遺傳分析儀校準(zhǔn)規(guī)范

JJF1838—20201遺傳分析儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于基于毛細(xì)管電泳原理的遺傳分析儀的校準(zhǔn),其他類型的遺傳分析儀可參照本規(guī)范執(zhí)行。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJG964—2001毛細(xì)管電泳儀凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3概述遺傳分析儀(以下簡(jiǎn)稱儀器)主要由毛細(xì)管電泳設(shè)備、控制及數(shù)據(jù)分析的計(jì)算機(jī)工作平臺(tái)及樣品編號(hào)輸入、設(shè)備控制及數(shù)據(jù)收集的軟件和數(shù)據(jù)分析軟件組成,可進(jìn)行片段多態(tài)性分析工作,包括微衛(wèi)星DNA分析、片段長(zhǎng)度分析(STR)、比較基因型分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)研究,還能夠完成對(duì)基因序列的測(cè)定或比較測(cè)序等工作。進(jìn)行DNA片段分析時(shí),采用不同標(biāo)記的引物對(duì)樣品基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行毛細(xì)管電泳,擴(kuò)增產(chǎn)物按照(片段長(zhǎng)度)分子量大小進(jìn)行區(qū)分,通過與分子量?jī)?nèi)標(biāo)及所設(shè)立的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行自動(dòng)比對(duì),以數(shù)字形式給出基因分型結(jié)果,并直接反映出STR位點(diǎn)等位基因中核心序列的重復(fù)次數(shù)。進(jìn)行測(cè)序分析時(shí),采用雙脫氧核苷酸末端終止法,對(duì)不同標(biāo)記的ddNTP的ATCG四種核苷酸通過檢測(cè)器進(jìn)行信號(hào)收集。儀器具有較為全面的DNA片段長(zhǎng)度分析和基因測(cè)序功能,能給使用者提供相應(yīng)的分析數(shù)據(jù),供法DNA分析、臨床診斷和研究使用。4計(jì)量特性4.1基線漂移4.2基線噪聲4.3定性(定量)重復(fù)性4.4通道差異4.5檢測(cè)限5校準(zhǔn)條件5.1環(huán)境條件儀器使用允許的環(huán)境條件,溫度:(15~35)℃、相對(duì)濕度:(10~80)%。開機(jī)預(yù)熱JJF1838—2020230min后進(jìn)行校準(zhǔn),校準(zhǔn)過程中測(cè)量并記錄環(huán)境的溫度、相對(duì)濕度。5.2校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及設(shè)備5.2.1校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5-羧基-X-羅丹明(5-carboxy-X-rhodamine,5-ROX)熒光修飾標(biāo)記DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[片段長(zhǎng)度:(100~400)bp],濃度值及不確定度范圍:(0.020μg/g±0.006μg/g)~(2.0μg/g±1.1μg/g),包含因子k=2。5.2.2校準(zhǔn)用設(shè)備移液器;最大量程2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL,且需要檢定合格。直角三角尺:分度值1mm,且需要檢定合格。6校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法將儀器各部分連接好,開機(jī),并通過自檢,各指示器正常工作。6.1基線漂移和基線噪聲以電阻率為18MΩ·cm(25℃)的蒸餾水為樣本進(jìn)行電泳,配制方案見表1。記錄基線45min,基線漂移用45min內(nèi)基線偏離起始點(diǎn)最大信號(hào)值(RFU/45min)表示。選取基線中噪聲最大峰的最高值(Hmax,RFU)、最低值(Hmin,RFU),按公式(1)計(jì)算基線噪聲(Nd)。用儀器檢測(cè)器自身的物理量(RFU)作為單位,用三角尺測(cè)量相關(guān)值。多通道的遺傳分析儀,以基線漂移和基線噪聲最大的泳道作為儀器的基線漂移和基線噪聲指標(biāo)。表1遺傳分析儀校準(zhǔn)電泳樣本配制方案試劑用量/μL甲酰胺8.90.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/電阻率為18.2MΩ·cm蒸餾水1Nd=Hmax-Hmin(1)式中:Nd—基線噪聲;Hmax—基線中噪聲最大峰的最高值,RFU;Hmin—基線中噪聲最大峰的最低值,RFU。6.2定性(定量)重復(fù)性將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.3~2)μg/g的熒光標(biāo)記DNA片段長(zhǎng)度混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣本進(jìn)行進(jìn)樣,配制方案見表1。用儀器自身分析軟件導(dǎo)出并記錄每個(gè)毛細(xì)管道片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如:300bp片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))原始測(cè)量譜圖的相對(duì)遷移時(shí)間和峰面積,連續(xù)測(cè)量5次。按公式(2)計(jì)算片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)遷移時(shí)間和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差,以各泳道中相對(duì)遷移時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大的作為儀器定性測(cè)量重復(fù)性,以峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大的作為儀器定量測(cè)量重復(fù)性。JJF1838—20203δ定性(定量)=(nX-iX)2×100%(2)式中:δ定性(定量)—定性(定量)重復(fù)性;Xi—第i次測(cè)得的遷移時(shí)間或峰面積; X—n次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值;i測(cè)量序號(hào);n—測(cè)量次數(shù)。6.3通道差異用儀器自身分析軟件導(dǎo)出并記錄6.2中每個(gè)毛細(xì)管管道DNA片段的原始測(cè)量譜圖的峰面積,取5次測(cè)量平均值。按公式(3)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為通道差異。δ泳道差異=(nX-iX)2·×100%(3)式中:δ泳道差異—泳道差異;Xi—第i個(gè)泳道測(cè)得的遷移時(shí)間或峰面積; X—n次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值;i測(cè)量序號(hào);n—測(cè)量次數(shù)。6.4檢測(cè)限將質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為(0.02~0.3)μg/g的熒光標(biāo)記DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣本,配制方案見表1,連續(xù)進(jìn)樣3次,用儀器自身分析軟件導(dǎo)出并記錄片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原始譜圖的峰高(也可打印出峰圖,以基線為基點(diǎn),用直角三角尺測(cè)量峰高),計(jì)算峰高的算術(shù)平均值。檢測(cè)限按公式(4)計(jì)算。D=2HNρ/H(4)式中:D—檢測(cè)限(最小檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)),μg/g;HN—噪聲峰高,RFU;ρ—樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/g;H—樣品峰高,RFU。7校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)校準(zhǔn)記錄應(yīng)盡可能詳盡地記載測(cè)量數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果,推薦的校準(zhǔn)記錄格式見附錄B。儀器測(cè)量結(jié)果的測(cè)量不確定度應(yīng)按JJF1059.1的要求評(píng)定,不確定度評(píng)定示例見附JJF1838—20204錄A。經(jīng)校準(zhǔn)的儀器應(yīng)出具校準(zhǔn)證書,校準(zhǔn)證書應(yīng)符合JJF1071—2010中5.12的要求,校準(zhǔn)證書的內(nèi)頁(yè)參考格式見附錄C。8復(fù)校時(shí)間間隔根據(jù)實(shí)際使用情況,用戶可自行確定儀器復(fù)校時(shí)間間隔,建議不超過1年。JJF1838—20205附錄A檢測(cè)限測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定示例A.1測(cè)量模型檢測(cè)限的計(jì)算公式為:D=2HNρ/H式中:D—檢測(cè)限(最小檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)),μg/g;HN—噪聲峰高,RFU;ρ—樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/g;H—樣品峰高,RFU。A.2不確定度來源測(cè)量中不確定度主要來源如下:—噪聲峰高測(cè)量引入的不確定度,用3次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差(極差法估算)與測(cè)量平均值的百分?jǐn)?shù)表示?！獦悠返馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)引入的不確定度,來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度?！獦悠贩甯邷y(cè)量引入的不確定度,用3次測(cè)量的極差與測(cè)量平均值的百分?jǐn)?shù)表示。A.3不確定度分量評(píng)定A.3.1噪聲峰高測(cè)量引入的相對(duì)不確定度ur1(Hi)計(jì)算各個(gè)泳道311bpDNA片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3次測(cè)量相對(duì)應(yīng)的噪聲峰高,按公式(A.1)計(jì)算各泳道噪聲峰高引入的相對(duì)不確定度ur1(Hi),測(cè)量數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見表A.1。ur1(Hi)=×100%(A.1)式中:C—3次測(cè)量的極差系數(shù)1.69;Hmax—基線中噪聲最大峰的最高值,RFU;Hmin—基線中噪聲最大峰的最低值,RFU; Hi—單個(gè)泳道的噪聲平均值,RFU。表A.1噪聲峰高測(cè)量引入的相對(duì)不確定度項(xiàng)目測(cè)量結(jié)果/RFU平均值/RFU極差/RFU相對(duì)不確定度ur1(Hi)第1次第2次第3次噪聲峰高15141514.714.0%A.3.2樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)引入的相對(duì)不確定度ur2(ρs)6樣品質(zhì)量濃度引入的相對(duì)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書得到,即ur2(ρs)=uc/k=2.7%/2=1.4%,k=2A.3.3樣品峰高測(cè)量引入的相對(duì)不確定度ur3(Hi)計(jì)算各個(gè)泳道311bpDNA片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)三次測(cè)量的相對(duì)應(yīng)的樣品峰高,按公式(A.2)計(jì)算其相對(duì)不確定度ur3(Hi),測(cè)量數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見表A.2。ur3(Hi)=×100%(A.2)式中:C—3次測(cè)量的極差系數(shù)1.69;ur3(Hi)———各個(gè)泳道樣品峰高引入的不確定度;Hi—單個(gè)泳道樣品峰高平均值,RFU;Hmax—基線中噪聲最大峰的最高值,RFU;Hmin—基線中噪聲最大峰的最低值,RFU。表A.2樣品峰高測(cè)量引入的相對(duì)不確定度項(xiàng)目測(cè)量結(jié)果/RFU平均值/RFU極差/RFU相對(duì)不確定度ur3(Hi)第1次第2次第3次樣品峰高987969981979181.1%A.4合成相對(duì)不確定度按公式(A.3)計(jì)算合成相對(duì)不確定度(A.3)ucr=u(Hi)+u(ρs)+u(Hi)(A.3)結(jié)果見表A.3。A.5相對(duì)擴(kuò)展不確定度相對(duì)擴(kuò)展不確定度按公式(A.4)計(jì)算,結(jié)果見表A.3。表A.3Ur=kucr合成相對(duì)不確定度和相對(duì)擴(kuò)展不確定度結(jié)果(A.4)項(xiàng)目ur1(Hi)ur2(ρs)ur3(Hi)合成相對(duì)不確定度ucr相對(duì)擴(kuò)展不確定度Ur(k=2)結(jié)果4.0%1.4%1.1%4.4%8.8%7附錄B校準(zhǔn)原始記錄參考格式送檢單位:校準(zhǔn)日期:年月日儀器名稱:制造廠:型號(hào):出廠編號(hào):證書編號(hào):環(huán)境溫度:℃相對(duì)濕度:%1.基線漂移和基線噪聲毛細(xì)管道基線最低值基線最高值基線變化值12345?2.定性定量測(cè)量重復(fù)性毛細(xì)管道遷移時(shí)間峰面積峰高12345?3.泳道差異毛細(xì)管道峰面積峰高1234?84.檢測(cè)限毛細(xì)管道噪聲峰高樣品峰高12345?校準(zhǔn)員: