色氨酸代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞

色氨酸代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞(2)自Tayor等提出IFN-γ對腫瘤生長得抑制作用就是其誘導(dǎo)色氨酸代謝所致得觀點后,與色氨酸分解代謝有關(guān)得酶——吲哚胺2,3雙加氧酶(IDO)和腫瘤得關(guān)系開始倍受關(guān)注。近期得研究發(fā)現(xiàn),在不同類型得腫瘤中,IDO可以扮演完全不同得角色。

在急性髓細(xì)胞樣白血病、黑色素瘤等腫瘤中,IDO可以通過抑制T細(xì)胞,從而促進(jìn)腫瘤得生長;而在肝癌等腫瘤中,IDO得存在可以提高機(jī)體得抗癌細(xì)胞作用,目前這一作用得具體機(jī)制尚不十分清楚。(3)IDO就是色氨酸分解代謝得限速酶,對色氨酸沿犬尿酸途徑進(jìn)行分解起到了重要作用。

IDO在多種組織中有表達(dá),在感染、腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期間,IDO得活性增強(qiáng),加速色氨酸得分解。脂多糖(LPS)、IFN-γ等細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等表達(dá)IDO。

IDO得分子式為:

NH2ONH2OHOIDO為偏脂溶性物質(zhì),可溶解于DMSO溶劑中。

IDO催化反應(yīng)如下:

色氨酸IDON-甲酰尿氨酸甲酰胺酶

L-犬尿素犬尿素3-羥化酶犬尿素酶3-羥基犬尿酸

鄰氨基苯甲酸犬尿素酶

非特異性羥化

羥基氨基苯甲酸

氧化酶

喹啉酸二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀:

IshioT等在體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn),外周單核細(xì)胞加入肝癌細(xì)胞株HepG2或PLC/PRF/5共同培養(yǎng)后,可顯著誘導(dǎo)單核細(xì)胞中IDOmRNA得表達(dá)。外周單核細(xì)胞抗肝癌細(xì)胞得細(xì)胞毒性作用正好與IDOmRNA得表達(dá)水平成正比,加入IDO得抑制劑1-甲基色氨酸(1-MT)后可以降低細(xì)胞毒性作用。IDO陽性得肝細(xì)胞癌病人在肝切除術(shù)后,無復(fù)發(fā)生存率高于IDO陰性得患者。

二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀:KaiS等證明IDO可以增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞(慢性髓性白血病細(xì)胞系)和HepG2細(xì)胞得功能。給與1-MT可以降低老鼠NK細(xì)胞毒素得活性。

二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀:GuidoFrumento等證明L-犬尿素、鄰吡啶甲酸和喹啉酸等色氨酸代謝產(chǎn)物可以抑制某些淋巴細(xì)胞得增殖。此效應(yīng)在色氨酸缺乏時更為明顯。DariuszPawlak等發(fā)現(xiàn)喹啉酸在1000μM/L濃度水平上可以降低HepG2細(xì)胞得活性。11大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀:

總之,IDO抗肝癌細(xì)胞得作用機(jī)制尚處于摸索階段,還有許多值得研究得地方。本課題將主要研究色氨酸在IDO催化下分解生成得幾種代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞得生長和凋亡有何影響。

研究方案

一研究目得

觀察色氨酸經(jīng)IDO催化后分解生成得各種代謝產(chǎn)物得量及其代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞得生長及凋亡得影響,為臨床治療肝癌提供新思路。二研究內(nèi)容高效液相色譜法測定色氨酸代謝產(chǎn)物得量。肝癌細(xì)胞得培養(yǎng)。MTT法測定代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞得增值得抑制作用及色氨酸缺乏對這一作用得影響。流式細(xì)胞術(shù)觀察代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期得影響。

三擬解決得關(guān)鍵問題

1

HepG2細(xì)胞得培養(yǎng)

2

從細(xì)胞水平來驗證色氨酸得代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞就是否有抑制增殖、周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡得作用。

3

各代謝產(chǎn)物濃度范圍及作用時間得選定均為本試驗得技術(shù)關(guān)鍵

4利用高效液相色譜法對色氨酸得代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析

四技術(shù)路線(第一步)。

HepG2細(xì)胞株

體外培養(yǎng)

細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml

分0、1,1,10,100,1000μM/L濃度加入代謝產(chǎn)物

12h,24h,36h,48h后分別檢測

MTT法

HepG2細(xì)胞抑制率

統(tǒng)計學(xué)分析

四技術(shù)路線(第二步)。

HepG2細(xì)胞株

體外培養(yǎng)

細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml

分0、5,5,50,500,5000μM/L濃度加入IDO

12h,24h,36h,48h后分別檢測MTT法HPLC法

HepG2細(xì)胞抑制率各代謝產(chǎn)物得量

統(tǒng)計學(xué)分析、

四技術(shù)路線(第三步)

HepG2細(xì)胞株

體外培養(yǎng)

細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml

根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果加藥,作用一定時間離心沉淀后收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5*106/ml流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期得變化分析結(jié)果六

實驗方案

1

細(xì)胞培養(yǎng):HepG2細(xì)胞株在DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。

2

加藥:將培養(yǎng)好得HepG2細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,制成104/ml單細(xì)胞懸液,置于反應(yīng)板內(nèi),同時加藥

(1)選定三種代謝產(chǎn)物(L-犬尿素、3-羥基犬尿酸、喹啉酸)進(jìn)行試驗。

色氨酸充足得條件下(30μM/L),將每種代謝產(chǎn)物分(0、1,1,10,100,1000μM/L)

5個濃度梯度,(12h,24h,36h,48h)4個反應(yīng)時間,用MTT法測細(xì)胞抑制率。繪制時間關(guān)系曲線。

另設(shè)色氨酸空白組為對照組

(2)色氨酸充足得條件下(30μM/L)加入IDO,分(0、5,5,50,500,5000μM/L)

5個濃度梯度(12h,24h,36h,48h)4個反應(yīng)時間,測細(xì)胞抑制率。

并用高效液相色譜法(HPLC)測出三種代謝產(chǎn)物(L-犬尿素、3-羥基犬尿酸、喹啉酸)生成得量。

3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期:選取某個代謝產(chǎn)物最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)時間離心收集細(xì)胞,然后調(diào)整細(xì)胞為5×106/ml,處理后24h內(nèi)上機(jī)分析。

4統(tǒng)計學(xué)分析:統(tǒng)計描述:均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,析因設(shè)計得方差分析,樣本之間比較用SNK-Q檢驗和t檢驗,P<0、05有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS11、0軟件。本課題得創(chuàng)新之處

首次將色氨酸在IDO得催化下分解生成得代謝產(chǎn)物單獨作用于HepG2肝癌細(xì)胞株,探討IDO抗肝癌細(xì)胞得作用機(jī)理,進(jìn)一步研究其對肝癌得潛在治療價值,并借此尋找肝癌治療得新途徑。研究計劃及預(yù)測進(jìn)展

2007年3月底之前:在導(dǎo)師得指導(dǎo)下,查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)資料,反復(fù)論證該課題得可行性、科學(xué)性、創(chuàng)新性;全面了解及掌握所需要得試劑等。2007年4月開始進(jìn)行預(yù)實驗,及時解決碰到得具體問題,并撰寫綜述。2007年6月后開始正式實驗,做好實驗紀(jì)錄。2007年10月爭取完成實驗。2007年11月后整理實驗紀(jì)錄,做統(tǒng)計學(xué)處理,撰寫科研論文。

預(yù)期研究成果

預(yù)計試驗結(jié)果為色氨酸代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞有抑制增殖,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期得作用,該作用隨藥物濃度和時間得增加而增強(qiáng)。色氨酸代謝產(chǎn)物有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡得作用。色氨酸代謝產(chǎn)物在肝癌治療上有潛在價值。在充分得理論,成熟得實驗條件,認(rèn)真仔細(xì)得工作之后,相信能得到滿意得結(jié)果。即使結(jié)果可能不盡人意,也會給以后得研究工作以寶貴得啟示。研究基礎(chǔ)

一學(xué)術(shù)條件:我院消化