革蘭氏染色和抗酸染色法

關(guān)于革蘭氏染色和抗酸染色法革蘭染色法革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家漢斯·克里斯蒂安·革蘭（Hans

ChristainGran）創(chuàng)立的。第2頁,共23頁，星期六，2024年，5月實驗?zāi)康暮鸵?.掌握革蘭氏染色方法的操作步驟及注意事項。2.了解革蘭氏染色的臨床意義。第3頁,共23頁，星期六，2024年，5月一、實驗原理二、實驗器材三、操作步驟四、注意事項五、革蘭染色的臨床意義第4頁,共23頁，星期六，2024年，5月（一）基本步驟：

1、初染：草酸胺結(jié)晶紫染色

2、媒染：碘液媒染

3、脫色：乙醇脫色

4、復染：石炭酸復紅復染一、實驗原理第5頁,共23頁，星期六，2024年，5月細菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫—碘的復合物，增強染料與細菌的結(jié)合力。（二）原理：第6頁,共23頁，星期六，2024年，5月當用脫色劑處理時，G+菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇脫色時細胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫—碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。G-菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高，所以當脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫—碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。第7頁,共23頁，星期六，2024年，5月細胞保留初染劑藍紫色的細菌為G+菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色（紅色）的細菌為G-菌。G-G+第8頁,共23頁，星期六，2024年，5月二、實驗器材大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，革蘭氏染色液，生理鹽水，載玻片，接種環(huán)，顯微鏡等。第9頁,共23頁，星期六，2024年，5月三、操作步驟第10頁,共23頁，星期六，2024年，5月1、涂片：將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別涂片、干燥、固定。

2、染色：（1）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗（2）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋一分鐘，水洗（3）脫色：將水甩凈，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約20—30秒，立即用水沖凈乙醇（4）復染：用番紅液染1--2分鐘，水洗

3、鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。第11頁,共23頁，星期六，2024年，5月四、注意事項第12頁,共23頁，星期六，2024年，5月1、注意涂片不宜過于濃厚。

2、火焰固定溫度要適宜。

3、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定。

4、染色過程中應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

5、選擇幼齡的細菌。G+菌培養(yǎng)12-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使G+菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第13頁,共23頁，星期六，2024年，5月五、革蘭染色的臨床意義1.對細菌的鑒別有重要意義2.指導臨床選擇用藥3.研究細菌與致病性的關(guān)系第14頁,共23頁，星期六，2024年，5月思考題：

當你對一株未知菌進行革蘭染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？

第15頁,共23頁，星期六，2024年，5月抗酸染色法第16頁,共23頁，星期六，2024年，5月【原理】結(jié)核桿菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色后，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經(jīng)美蘭復染，結(jié)核桿菌及其它分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質(zhì)等呈藍色。第17頁,共23頁，星期六，2024年，5月【材料】①結(jié)核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。②石炭酸復紅染色液，3%鹽酸酒精，堿性美藍染液③生理鹽水④載物玻片，濾紙片、接種環(huán)、玻片夾、酒精燈、蠟筆等第18頁,共23頁，星期六，2024年，5月【方法】1．涂膜痰的涂片：用滅菌的接種環(huán)采取痰中干酪壞死的小塊或帶血的痰液，在載玻片上涂成薄而均勻的膜（在燒接種環(huán)時為防止痰中的細菌濺出，可先將接種環(huán)在內(nèi)焰燒干，然后再于外焰中滅菌）。第19頁,共23頁，星期六，2024年，5月2．染色（1）在已固定好的涂片上放置濾紙片（濾紙的作用是濾去染液中的沉渣，使標本清晰），滴加石炭酸變紅染色液于濾紙片上（應(yīng)滴滿濾紙片）。（2）將加有染液的涂片加溫，在火焰上保持一定的高度，直到出現(xiàn)蒸汽（不得沸騰）如此反復2—3次（約5分鐘）。在加溫過程中防止將染液烘干（應(yīng)及時添加染液）。（3）去掉濾紙片，使涂片冷卻，水洗。（4）用3%鹽酸酒精脫色，直到流下的脫色劑無色為止，水洗。（5）用堿性美藍染液復染30秒，水洗、干燥、鏡檢。第20頁,共23頁，星期六，2024年，5月【結(jié)果觀察】1.結(jié)核桿菌染成紅色，細長，直的或為微彎曲，有的可表現(xiàn)出分枝特征，偶而有著色不勻，成顆粒狀者。亦可以見到有縱行條索狀排列。標本的其余部分及非抗酸性細菌染成藍色。必須逐一觀察各個視野，直待全部涂片找不到結(jié)核桿菌時，才可報告陰性。第21頁,共23頁，星期六，2024年，5月2.涂片染色能查到結(jié)核桿菌者，一般需要每ml痰液內(nèi)含菌量至少應(yīng)