動物細胞工程

細胞工程概況細胞工程概況什么是細胞工程？細胞工程概況

應(yīng)用現(xiàn)代細胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法，按照人們的需要和設(shè)計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。細胞工程的發(fā)展史細胞工程概況1665年，胡克利用顯微鏡第一次觀察到了細胞1997年，“多莉”羊的誕生1839年，施旺提出“細胞學(xué)說”1940，Earle首創(chuàng)單個細胞克隆培養(yǎng)，建立小鼠結(jié)締組織L細胞系1978年胚胎工程技術(shù)成功培育出世界首例試管嬰兒細胞工程的發(fā)展史細胞工程概況動物細胞工程植物細胞工程微生物細胞工程細胞工程的分類糧食生產(chǎn)畜牧生產(chǎn)臨床醫(yī)學(xué)與藥物科學(xué)研究細胞工程的應(yīng)用動物細胞工程主要研究內(nèi)容細胞工程概況動物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞核移植胚胎工程干細胞與組織工程轉(zhuǎn)基因動物認識細胞細胞工程概況分類：原核細胞、真核細胞大小形態(tài)：體形極微，形態(tài)多樣特點：動物細胞無細胞壁認識細胞細胞工程概況細胞膜磷脂雙分子層、蛋白質(zhì)及糖鏈構(gòu)成細胞質(zhì)

線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體、溶酶體、中心體等細胞核

核膜、染色質(zhì)、核液和核仁細胞---周期細胞工程概況

細胞的繁殖是通過細胞的分裂來實現(xiàn)的，連續(xù)分裂的細胞從一次分裂完成時開始到下一次分裂完成時為止。分裂真核細胞有絲分裂減數(shù)分裂無絲分裂細胞—其他活動細胞工程概況分化死亡細胞壞死細胞凋亡課堂小結(jié)細胞工程概況細胞工程概況定義發(fā)展史分類應(yīng)用動物細胞工程主要研究內(nèi)容細胞分類形態(tài)結(jié)構(gòu)基本活動動物組織、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)及其基本原理基本原理細胞培養(yǎng)及其基本原理

動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中讓這些細胞生長和增殖。

細胞的增殖分化原理

原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過程細胞培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)及其基本原理培養(yǎng)條件無菌無毒營養(yǎng)物質(zhì)血清血漿

溫度pH氣體環(huán)境細胞培養(yǎng)分類：細胞培養(yǎng)及其基本原理原代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)根據(jù)細胞種類貼壁細胞培養(yǎng)半懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方式原代培養(yǎng)細胞培養(yǎng)及其基本原理取出動物組織塊剪碎胰蛋白酶或EDTA等消化加入培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的細胞為正常的動物細胞，一般培養(yǎng)10代后不再增殖，死亡。傳代培養(yǎng)細胞培養(yǎng)及其基本原理

當(dāng)細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長，這一過程就叫傳代。細胞株與細胞系細胞培養(yǎng)及其基本原理細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞系隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂細胞復(fù)蘇、凍存與運輸細胞復(fù)蘇細胞復(fù)蘇、凍存與運輸防止污染（無菌操作）解凍快速細胞凍存細胞復(fù)蘇、凍存與運輸對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗、消化1000rpm，5min密度為5×106/ml～1×107/ml；每管1～1.5ml；標(biāo)明細胞的名稱，凍存時間及操作者將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜。凍存液：10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清細胞的運輸01充液法運輸細胞復(fù)蘇、凍存與運輸

選用生長性狀良好的細胞，當(dāng)細胞貼壁長至1/2瓶底或接近連接成片時，去掉培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液至培養(yǎng)瓶頸部（保留少量空氣），擰緊瓶蓋。然后乙醇消毒瓶蓋并用膠帶將瓶口密封，瓶周圍用棉花包裹，作防震防壓處理，運送過程要注意保溫。02冰凍法運輸

1.使用制式液氮罐運輸：將細胞凍存管放入制式的運送液氮罐中進行運輸，在液氮罐搬運過程中，要防止液氮外漏。2.使用裝有干冰的泡沫塑料盒運輸。要迅速將細胞凍存管從液氮中取出轉(zhuǎn)入干冰中，否則細胞將會以10～20℃/min的速度升溫，而且絕不能讓細胞溫度高于-50℃。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

指在人工條件下（設(shè)定ph、溫度、溶氧等），在細胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。

貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)類型生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細胞介素、藥物等應(yīng)用中應(yīng)用動物細胞融合動物細胞融合動物細胞融合

也稱細胞雜交，是指在一定的條件下將兩個或多個動物細胞融合為一個細胞的過程。動物細胞融合動物細胞融合動物細胞融合雜交細胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。同核體：基因型相同的細胞融合成的雜交細胞。異核體：來自不同基因型的雜交細胞。自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)時2個靠在一起的細胞自發(fā)合并。誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。動物細胞融合原理動物細胞融合原理動物細胞融合原理原理：細胞膜具有一定的流動性誘導(dǎo)融合因素：生物方法（病毒）化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）物理方法（離心，震動，電刺激）基因產(chǎn)物：mRNA、tRNA、rRNA動物細胞融合的具體步驟動物細胞融合的具體步驟動物細胞融合的具體步驟分貼壁和懸浮細胞兩種。前者可直接將兩親本細胞混合培養(yǎng)，后者需制成一定濃度的細胞懸浮液。細胞準備細胞融合雜種細胞選擇雜種細胞克隆加促融因子于將行融合的細胞之中，誘導(dǎo)融合。利用選擇性培養(yǎng)基等，使親本細胞死亡，而讓雜種細胞存活。對選出的雜種細胞進行克?。ㄟx擇與純化），經(jīng)過培養(yǎng)，就能獲得所需要的無性繁殖系。動物細胞融合技術(shù)應(yīng)用動物細胞融合技術(shù)應(yīng)用動物細胞融合技術(shù)應(yīng)用細胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能；成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段；利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。動物細胞融合與植物細胞雜交的比較動物細胞融合與植物細胞雜交的比較動物細胞融合植物細胞雜交融合原理細胞膜流動性細胞膜流動性，植物細胞全能型融合預(yù)處理用胰島蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合用纖維素酶、果膠酶去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合誘導(dǎo)方法滅活的病毒、電激、聚乙二醇電激、振動、離心、聚乙二醇結(jié)果雜交細胞雜交植株應(yīng)用制備單克隆抗體、病毒疫苗、干擾素等克服遠緣雜交不親和的障礙，擴展雜交親本范圍，培育新品種思考題：思考題：為什么細胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活的病毒可以作為誘導(dǎo)劑嗎？單克隆抗體制備獲得抗體的傳統(tǒng)方法

特點：效率低，純度低，特異性差獲得抗體的傳統(tǒng)方法

將抗原反復(fù)注入動物體,然后從動物血清中提取抗體。

如何獲得大量的、特異性強的抗體？抗原吞噬細胞攝取處理T細胞抗原呈遞B細胞直接刺激漿細胞增殖、分化抗體產(chǎn)生從動物血清中分離淋巴因子獲得抗體的傳統(tǒng)方法單克隆抗體的原理及定義

將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎獲得抗體的傳統(tǒng)方法單克隆抗體的制備制備動物免疫細胞融合細胞篩選抗體檢測克隆化單抗獲得單克隆抗體的制備制備抗原免疫小鼠B淋巴細胞骨髓瘤細胞培養(yǎng)骨髓瘤細胞細胞融合雜交瘤細胞單克隆抗體的制備制備置于選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)B淋巴細胞培養(yǎng)數(shù)天后死亡缺乏相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，骨瘤細胞死亡多孔細胞培養(yǎng)，篩選單一雜交瘤細胞；進行單一抗體檢測多種雜交瘤細胞篩選出所需細胞擴大培養(yǎng)體外培養(yǎng)腹水中提取體內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)液中提取單克隆抗體單克隆抗體的特點單克隆抗體的特點特點類型合成分泌細胞提取途徑功能特性生產(chǎn)特點傳統(tǒng)抗體體內(nèi)的多種B淋巴細胞從血清中提取種類多樣特異性差純度低產(chǎn)量低單克隆抗體體外培養(yǎng)或移植到小鼠腹腔培養(yǎng)的單一雜交瘤細胞產(chǎn)生的細胞群從雜交瘤細胞的培養(yǎng)液或小鼠腹腔的腹水中提取種類單一特異性強純度高產(chǎn)量高單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用應(yīng)用疾病診斷疾病治療載體藥物：生物導(dǎo)彈課堂小結(jié)課堂小結(jié)制備單克隆抗體的原理每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。骨髓瘤細胞具有無限增殖的特性。制備單克隆抗體的過程動物免疫細胞融合細胞篩選抗體檢測單抗獲得課后思考為什么選用B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合？細胞核移植與克隆細胞核移植與克隆細胞核移植與克隆你知道小羊“多莉”嗎？細胞核移植與克隆動物細胞核移植技術(shù)

動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體。細胞核移植與克隆

動物細胞核具有全能性原理分類細胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易胚胎細胞核移植細胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易體細胞核移植細胞核移植與克隆核移植技術(shù)的流程細胞核移植與克隆母綿羊A

乳腺細胞

（體細胞）

母綿羊B未受精的卵細胞母綿羊C“多莉”

新的卵細胞發(fā)育成早期胚胎去核卵細胞提取細胞核核移植胚胎移植MⅡ期卵母細胞取供體細胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細胞融合方法：電刺激細胞核移植與克隆體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用加速家畜遺傳改良保護瀕危物種生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)組織器官的移植認識胚胎發(fā)育和衰老過程研究疾病的發(fā)展歷程細胞核移植與克隆課堂小結(jié)核移植概念分類過程應(yīng)用胚胎細胞核移植體細胞核移植畜牧業(yè)醫(yī)療健康細胞核采集去核卵母細胞重組胚胎構(gòu)建胚胎移植克隆動物細胞核移植與克隆課后思考用體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是否對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制？為什么？干細胞技術(shù)干細胞技術(shù)干細胞定義及分類干細胞技術(shù)

干細胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細胞,能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。分類按分化潛能分

按來源分胚胎干細胞成體干細胞全能干細胞多能干細胞單能干細胞胚胎干細胞（ES細胞）干細胞技術(shù)

胚胎干細胞（Embryonicstemcell，ESCs，簡稱ES、EK或ESC細胞）是早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來的一類細胞。生物學(xué)特性全能性或多能性種系傳遞性體外遺傳可操作性無限擴增(自我更新)面臨問題干細胞技術(shù)來源問題（宗教、法律及文化背景）擴增變異技術(shù)普及成體干細胞干細胞技術(shù)

成體干細胞是指存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細胞，這種細胞能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細胞。生物學(xué)特性多能性遷移性可調(diào)控性廣泛性相對容易獲取不存在組織相容性致瘤風(fēng)險很低，倫理學(xué)爭議較少多向分化潛能優(yōu)點分析分類干細胞技術(shù)成體干細胞造血干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞神經(jīng)干細胞肝干細胞腸上皮干細胞肌肉衛(wèi)星細胞胰腺干細胞視網(wǎng)膜干細胞誘導(dǎo)性多能干細胞（iPS）干細胞技術(shù)

誘導(dǎo)性多能干細胞(Inducedpluripotentstemcell