細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法

細(xì)胞傳代培養(yǎng)及細(xì)胞計(jì)數(shù)5/9/20241細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法人癌細(xì)胞系傳代培養(yǎng)1.觀察：培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，占瓶底80%-90%，無污染；2.棄廢液：倒掉瓶中培養(yǎng)液，盡量瀝干液體；3.漂洗：加1ml0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,棄去消化液；4.消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,保留約0.3ml,室溫放置3～5min；5.吹打：鏡下看到細(xì)胞收縮變園,加1～2ml含血清培養(yǎng)液,用吸管按順序輕輕吹打，避免出現(xiàn)泡沫；6.計(jì)數(shù)：取樣,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度；7.接種及培養(yǎng)：按104

細(xì)胞/ml接種,37℃、5%CO2

，飽和濕度條件下培養(yǎng)。5/9/20242細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法注意事項(xiàng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積80%左右時(shí),開始傳代。首次傳代培養(yǎng)應(yīng)適當(dāng)提高接種細(xì)胞濃度。細(xì)胞混雜生長(zhǎng)時(shí),可根據(jù)需要選擇合適的方法純化細(xì)胞。

5/9/20243細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法5/9/20244細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法5/9/20245細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法5/9/20246細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板法制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞密度＞104/ml,細(xì)胞過多時(shí)需適當(dāng)稀釋,單個(gè)細(xì)胞率>95%。加樣：混懸細(xì)胞，取少許細(xì)胞懸液，從計(jì)數(shù)池一側(cè)加入，不要溢出或出現(xiàn)氣泡。計(jì)數(shù)：10倍物鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞，壓線者只計(jì)左邊線和上邊線。計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml=（四大格細(xì)胞總數(shù)／4）×104×稀釋倍數(shù)5/9/20247細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法5/9/20248細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞活力測(cè)定－臺(tái)盼藍(lán)染色法制備單個(gè)細(xì)胞懸液：105～106／ml染色：0.04%臺(tái)盼藍(lán)染色1min(9滴細(xì)胞懸液＋1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán))，3min內(nèi)計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（染料拒染）和死細(xì)胞（呈淡藍(lán)色）計(jì)算細(xì)胞活力：活細(xì)胞率（％）＝［活細(xì)胞數(shù)／（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）］×1005/9/20249細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法5/9/202410細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞密度調(diào)整稀釋公式：C1·V1＝C2·V2稀釋前細(xì)胞密度C1，溶液體積V1稀釋后細(xì)胞密度C2，溶液體積V25/9/202411細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)106/mlCellsusspension105/ml104/ml103/ml0.1ml0.1ml0.1mlMedium0.9ml5/9/202412細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定－計(jì)數(shù)法DT=t×lg2÷(lgNt－lgNo)5/9/202413細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法培養(yǎng)細(xì)胞的純化方法機(jī)械刮除法：用細(xì)胞刮刮出不需要的細(xì)胞差速粘附法：成纖維樣細(xì)胞，上皮樣細(xì)胞選擇性酶消化法：金屬管套取需要的細(xì)胞密度梯度離心法：細(xì)胞漂浮密度，

Ficoll,Percoll克隆化培養(yǎng)法：瓊脂法，有限稀釋法免疫磁珠分離法：細(xì)胞表面標(biāo)志，免疫磁珠速度沉降法：細(xì)胞大小，離心淘洗技術(shù)電泳分離法：細(xì)胞表面電荷5/9/202414細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的問題培養(yǎng)液pH值快速偏離：CO2濃度異常，培養(yǎng)瓶蓋過緊；細(xì)菌、酵母或霉菌污染培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀：細(xì)菌或霉菌污染細(xì)胞不貼壁：胰酶過度消化細(xì)胞，支原體污染，缺乏附著因子

5/9/202415細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞死亡：孵箱中缺CO2

，孵箱溫度不穩(wěn)定，細(xì)胞凍融損傷，滲透壓改變，培養(yǎng)液中毒性代謝產(chǎn)物堆積細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢：培養(yǎng)液或血清改變，基本促生長(zhǎng)成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生長(zhǎng)因子等，低