熒光熒光第三部分

熒光熒光第三部分八、熒光標(biāo)記物和標(biāo)記反應(yīng)和氨基反應(yīng)的和巰基反應(yīng)的和其他基團反應(yīng)的第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1.和氨基反應(yīng)的第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天fluorescein-5-isothiocyanate(FITC'IsomerI')

MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38CASNumber/Name:3326-32-7/Spiro(isobenzofuran-1(3H),9'-(9H)xanthen)-3-one,3',6'-dihydroxy-5-isothiocyanato-第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天fluorescein-6-isothiocyanate(FITC'IsomerII')

MolecularFormula:C21H11NO5SMolecularWeight:389.38CASNumber/Name:18861-78-4/Spiro(isobenzofuran-1(3H),9'-(9H)xanthen)-3-one,3',6'-dihydroxy-6-isothiocyanato-第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonylchloride(dabsylchloride)

MolecularFormula:C14H14ClN3O2SMolecularWeight:323.80CASNumber/Name:56512-49-3/Benzenesulfonylchloride,4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天RhodamineRed?-X,succinimidylester

MolecularFormula:C37H44N4O10S2MolecularWeight:768.90CASNumber/Name:N/A第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天TexasRed?sulfonylchloride

MolecularFormular:C31H29ClN2O6S2MolecularWeight:625.15CASNumber/Name:82354-19-6/1H,5H,11H,15H-Xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']diquinolizin-18-ium,9-[2(or4)-(chlorosulfonyl)-4(or2)-sulfophenyl]-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-,innersalt第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天Spectra—TexasRed-BSAconjugate

AbsorptionandfluorescenceemissionspectraoftheTexasRedconjugateofbovineserumalbumin(A-23017)inpH7.0buffer.第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞微絲成像用AlexaFluor430標(biāo)記抗體實現(xiàn)微絲染色第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天斑馬魚視網(wǎng)膜綠色：AlexaFluor488標(biāo)記藍(lán)色：Hoechst33258染核第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2.和巰基反應(yīng)第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天AlexaFluor488C5maleimine第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5-(bromomethyl)fluorescein第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天Tetramethylrhodamine-5-maleimide第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天AlexaFluor350,488,568：核、微管、特殊蛋白第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3.標(biāo)記其他基團羥基：蛋白質(zhì)中絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基；糖類第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天NBD-Cl第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天肼和芳香胺用來標(biāo)記醛、酮第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天APTSFluorescein-5-thiosemicarbazide第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天九、熒光分析方法常規(guī)熒光分析法三維熒光分析法時間分辨熒光分析法能量轉(zhuǎn)移熒光分析法熒光免疫分析超靈敏技術(shù)（信號放大）第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、常規(guī)熒光分析法熒光生成/增敏法熒光猝滅法同步熒光分析法第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（1）、熒光生成/增敏法

1.待測物本身有熒光，可以直接進(jìn)行測定

2.待測物沒有熒光或熒光較弱，則反應(yīng)產(chǎn)生熒光衍生物進(jìn)行測定第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系

It=AI0e-kcldI=AI0e-kcx－AI0e-kc(x+dx)

=AI0e-kcx(1－e-kcx)因dxkc很小dI=AI0kce-kcx.dxdF=KdI=KAI0kce-kcxdx液槽中溶液熒光強度

F=KAI0kc∫0le-kcxdx=KAI0[1－e-kcl]=AKI0[kcl－(kcl)2/2!+(kcl)3/3!－…]=AKI0kcl[1－kcl/2+(kcl)2/6－…]第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)kcl≤0.05則括號內(nèi)第二項開始可忽略不計F=AKI0kcl對1cm2吸光截面F=2.3φI0εclA不超過0.05第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（2）、熒光猝滅法待測物沒有熒光，但它可以通過動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅的過程使一熒光物的熒光猝滅進(jìn)行測定。

如：O2猝滅芘丁二酸的熒光，用于測定血液中的氧

S2-猝滅熒光素汞的熒光用于測定環(huán)境中石油及天然氣中的痕量硫

第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（3）、同步熒光分析法同步熒光是在同時掃描兩個單色器波長的情況下測繪的熒光光譜，根據(jù)激發(fā)和發(fā)射兩個單色器在同時掃描過程中彼此間所應(yīng)保持的關(guān)系，同步熒光測定可分為三個類型：1．

固定波長同步熒光，在同時掃描過程中使激發(fā)波長和發(fā)射波長彼此保持固定的波長間隔，即λem-λex=常數(shù)。2．

固定能量同步熒光，在同時掃描過程中使激發(fā)波長和發(fā)射波長之間保持一個固定的能量差（1/λex-1/λem）X107=△v=常數(shù)△v表示能量差（cm-1）即激發(fā)和發(fā)射兩個單色器之間保持固定波數(shù)差進(jìn)行掃描可變角（或可變波長）同步熒光：在同時掃描過程中使激發(fā)和發(fā)射兩個單色器以不同的速率同時進(jìn)行掃描，第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天同步熒光法優(yōu)點光譜簡化譜帶窄化減小光譜重疊減小散射光的影響第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2、三維熒光分析法第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3、時間分辨熒光分析法第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4、能量轉(zhuǎn)移熒光分析法第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天茶葉堿的測定第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天HIV的測定HIVprotease檢測原理第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5、熒光免疫分析

(FluorescenceImmunoassay)

BersonandYalowRIA1959

Antigen,AgAntibody,Ab

RIAELIAFIACLIA第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天6、超靈敏檢測酶標(biāo)熒光放大技術(shù)熒光微球第38頁,共43頁，2024年