小鼠草酸鈣腎結(jié)石模型建立的初步探索

小鼠草酸鈣腎結(jié)石模型建立的初步探索

摘要：目的探索一種簡便、成石效果好的小鼠草酸鈣腎結(jié)石模型。方法采用1%乙二醇自由飲水法增加小鼠尿草酸和/或腹腔注射10%葡萄糖酸鈣增加尿鈣排出量，比較小鼠24小時尿草酸（Ox）、尿鈣（Ca2+）、過氧化氫H2O2、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛（MDA）含量，觀察腎草酸鈣結(jié)晶形成情況，免疫組化法觀察CD68蛋自在腎臟中的表達位置并用灰度值法計算其表達水平，評價小鼠草酸鈣腎結(jié)石造模效果。結(jié)果單獨誘導(dǎo)高草酸尿或高鈣尿的小鼠腎內(nèi)氧化應(yīng)激指標增高和巨噬細胞浸潤增多但未見結(jié)晶，同時介導(dǎo)高草酸尿和高鈣尿的小鼠腎內(nèi)氧化應(yīng)激損傷指標增高和巨噬細胞浸潤增多且有較多結(jié)晶。結(jié)論單獨誘導(dǎo)高草酸尿和高鈣尿不足以使小鼠腎內(nèi)生成結(jié)晶，同時誘導(dǎo)高草酸尿和高鈣尿成石效果好，巨噬細胞可能在腎結(jié)晶形成和/或清除中起到重要作用。關(guān)鍵詞：草酸鈣；腎結(jié)石；動物模型；小鼠泌尿系結(jié)石草酸鈣大鼠動物模型腎結(jié)石是一種常見疾病，其中草酸鈣結(jié)石居多。因此實驗動物草酸鈣結(jié)石模型是腎結(jié)石基礎(chǔ)與臨床研究的重要方法。目前國內(nèi)主要通過乙二醇飲水法介導(dǎo)大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型[1]。用小鼠誘導(dǎo)草酸鈣腎結(jié)石模型比較少見。目前認為，小鼠較之于大鼠腎結(jié)石形成有較高的耐受性，草酸鈣晶體形成幾天后即被清除[2]。因此建立一個成石效果好，且簡便，經(jīng)濟的小鼠草酸鈣腎結(jié)石模型并研究小鼠腎內(nèi)一些結(jié)石相關(guān)的指標變化及結(jié)晶清除機制，對研究腎結(jié)石的形成機制和指導(dǎo)臨床治療有重要的意義。1材料1．2試劑與儀器乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）測試盒，南京建成生物工程研究；CD68兔抗小鼠多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；乙二醇(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)。2550型紫外一可見光分光光度計(日本島津公司)；病理圖像分析儀（德國萊卡公司），離子色譜儀（德國DIONEX公司）；自動生化分析儀（美國雅培公司）；LAMBDABIO20雙光束紫外分光光度計（美國PE公司）；7170A自動生化分析儀（日本日立公司）JAl203型電子天平(上海天平儀器廠)。1．2動物昆明小白鼠40只，雄性，體重18～23g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。2方法2．1動物分組及給藥方法動物飼養(yǎng)1周后，選體重20-25g昆明小白鼠隨機分為4組，每組10只，正常顆粒飼料喂養(yǎng)。造模A組：1％乙二醇飲水；造模B組：1％乙二醇+10％葡萄糖酸鈣，ip2mL/kg·d；造模C組：10％葡萄糖酸鈣，ip2mL/kg·d造模D組：正常飲水。各組小鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)。造模共8周。2．2觀察指標及檢測方法實驗結(jié)束前用代謝籠收集并測24h尿量以及用于檢測尿草酸（離子色譜法）、尿鈣（自動生化分析）、過氧化氫、乳酸脫氫酶、丙二醇的濃度。脫頸椎處死小鼠，切取小鼠的雙腎，觀察其外觀改變，右腎置10％中性福爾馬林中固定，作常規(guī)HE石蠟切片和VonKossa染色及免疫組化，左腎精密稱重后計算各組大鼠的左腎/體重比值。2．3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以X±S表示，用SPSS16．0統(tǒng)計軟件分析。計量資料組間比較用One．WayANOVA方差分析，LSD用于比較組內(nèi)差別。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3．1動物存活情況各組至實驗結(jié)束均無動物死亡。3．2各組小鼠24h尿草酸、鈣離子、左腎/體重比值與D組比較，飲用了乙二醇的A、B組尿草酸排泄量顯著增加，但兩者之間無顯著差異（P>0.05）；而腹腔注射了葡萄糖酸鈣的B、C組尿鈣排泄量顯著增加，但兩者間無顯著差異（P>0.05）；與D組比較，B組腎臟/體重比值高于D組（P<0.05）。表2.各實驗組客觀指標H2O2、MDA、LDH的表達Ox（mg/ml）Ca2+（mmol/ml）左腎體重比值A(chǔ)組0.0671±0.0067#0.0770±0.007180.00777±0.00111#B組0.0637±0.0105#0.2551±0.01401#0.00783±0.00102#C組0.0161±0.0036#0.2718±0.01415#0.00504±0.0007D組0.0190±00420.0789±0.00690.00643±0.00165“#”代表與空白組比較，P<0.053．3各組小鼠24h尿乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）含量與D組比較，運用了藥物干預(yù)的A、B、C3組尿H2O2、LDH濃度顯著增加，但三者之間無顯著差異（P<0.05）；A、B2組尿液MDA、顯著增高（P<0.05）。表2.各實驗組客觀指標H2O2、MDA、LDH的表達。H2O2（mmol/ml）MDA（nmol/ml）LDH（U/L）A組49.61±6.345#1.787±0.417#867.83±156.80#B組51.803±6.289#1.603±0.495#905.26±174.42#C組