藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析

藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析抗體

---生物體自造的“magicbullet”醫(yī)療

直接或與毒素連結(jié)攻擊

病變細(xì)胞研究

各種免疫分析第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天抗體藥物銷售趨勢(shì)圖第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天國(guó)際抗體藥物2009年美國(guó)市場(chǎng)上的抗體藥物成為生物技術(shù)藥物銷售額最大的類別。2010年美國(guó)市場(chǎng)的單抗藥物銷售額為185億美元2011年，全球單抗藥物的市場(chǎng)總量已經(jīng)達(dá)到628億美元，世界范圍內(nèi)的單抗藥物銷份額約是整個(gè)生物制藥市場(chǎng)份額的36%。第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天國(guó)內(nèi)抗體藥物目前我國(guó)的上市抗體品種中,國(guó)外進(jìn)口單抗占據(jù)多數(shù)2011年國(guó)內(nèi)市場(chǎng)規(guī)模超過10億元我國(guó)抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素：動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為各個(gè)國(guó)家生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的核心競(jìng)爭(zhēng)點(diǎn)抗體下游純化成本已占45%到70%高質(zhì)量純化工藝研究刻不容緩QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）理念的應(yīng)用第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天抗體偶聯(lián)藥物(AntibodyDrugConjugates，ADC)結(jié)合單克隆抗體的靶

向性和小分子藥物的

高度細(xì)胞毒性，可以

有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，

在臨床前研究、甚至人體臨床研究中，取得了良好的抗腫瘤效果，成為生物藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一;ADC藥物為疾病的“精準(zhǔn)醫(yī)療”提供有效的武器?？贵w-藥物偶聯(lián)劑（ADCs）的研究進(jìn)展與產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀:/master/liuboning/584302.shtml第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Antibodyandstructure特點(diǎn)：2個(gè)基因決定一個(gè)蛋白質(zhì)與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，高度專一性第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天抗原和抗原決定簇一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定簇每個(gè)抗原決定簇至少誘生一種專一性抗體蛋白質(zhì)抗原的決定簇含有六個(gè)以上氨基酸第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

。

第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天克隆選擇

學(xué)說第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天單抗和多抗多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)多種抗原決定簇的多種抗體混合物，如免疫血清。單克隆抗體（monoclonalantibody）指由一種

B細(xì)胞生產(chǎn)，針對(duì)某一抗原決定簇的單一抗體。第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Preparationofpolyclonalantibodies傳統(tǒng)抗血清抗原免疫混合抗體123412341234免疫前要先把抗原作成乳劑約在兩月內(nèi)注射五到八次第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Preparationofmonoclonalantibodies第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Preparationofrecombinantantibodies淋巴細(xì)胞總RNA抗體輕、重鏈文庫重組單鏈抗體基因輕、重單鏈基因大腸桿菌表達(dá)體系單鏈抗體第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天單鏈抗體在重鏈與輕鏈之間加上一段連接肽，連成一條單鏈如果僅是兩條鏈的可變區(qū)，稱為ScFv連接肽的長(zhǎng)度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長(zhǎng)或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是GGGGS×3第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Abasantigen-PrimaryandsecondaryantibodyPrimaryAbSecondaryAbPrimaryAbProteinA二抗針對(duì)一抗的物種特異性ProteinA針對(duì)所有動(dòng)物抗體Fc第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天ImmunoassaysThemostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforcomplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy

第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天抗體的標(biāo)記方法放射性同位素標(biāo)記酶標(biāo)記熒光標(biāo)記有機(jī)分子熒光標(biāo)記綠色熒光蛋白標(biāo)記稀土熒光標(biāo)記通用標(biāo)記第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天放射性碘標(biāo)記第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天HRP酶標(biāo)記簡(jiǎn)單化學(xué)偶聯(lián)方法：

1．過碘酸鈉法：

僅用于HRP的標(biāo)記。HRP是一種糖蛋白，過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，再與抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)后，再加人硼氫化鈉(NaHB4)還原后，形成穩(wěn)定的HRP—CH2—NH—IgG酶標(biāo)記物。為防止酶蛋白氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，常在標(biāo)記前知用二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白上的α和ε氨基。

2．戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法：

戊二醛具有兩個(gè)活性醛基，分別與酶分子和抗體分子上的氨基結(jié)合。NaHB4HRP第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天LabelingwithisoFITC第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天GFPlabelingGFPgeneScFvgeneVectorexpressionGFPgeneProteinAgeneVectorexpressionAb-Fc第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天通用標(biāo)記+Avidin/streptA+Anti-digoxinAb2ndAbProteinAPrimaryAbPrimaryAb第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天ImportantassaysImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIA—competentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA---homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天ImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞單層細(xì)胞/組織固定免疫染色（熒光）顯微鏡觀察第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光標(biāo)記的c-Mycphalloidin熒光標(biāo)記的微絲熒光染色的細(xì)胞核合成圖像第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Immunoblot---WesternBlot第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天ElectroblottinggelPVDFmembrane第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Immunostaining封閉分析抗體顯色抗體顯色數(shù)字化灰度圖像分析第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天0.51246812162430(h)c-mycp53CyclinD1Actin第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天CaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotin第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天RIAAssay第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天免疫競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析---小分子抗原分析的基本方法Ag+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag[*AgAb:Precipitant↓]放射性計(jì)數(shù)第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天常用分離沉淀技術(shù)鹽析法：飽和硫酸銨、硫酸鈉聚乙二醇法（w=6000）特點(diǎn)：快速，價(jià)廉，來源方便，受環(huán)境影響大抗體免疫沉淀法特點(diǎn)：分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價(jià)高，但成本高固相吸附劑第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天RIA測(cè)量步驟恒量的*Ag、Ab加入反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品、或標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度）37℃或4℃溫育加入分離劑分離結(jié)合及游離部分測(cè)定以總放射性為分母，測(cè)定*AgAb為分子，計(jì)算結(jié)合%，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，濃度為坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)樣品的結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Calibrationcurve第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay）第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天SandwichELISA競(jìng)爭(zhēng)法（略）第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天HighConvenienceHighSensitivity第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天96-wellplate包被封閉結(jié)合顯色酶標(biāo)儀測(cè)定hv洗滌洗滌洗滌終止第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天酶的底物

鄰苯二胺(OPD)+H2O2

TMBABTSHRP的底物氧化產(chǎn)物(橙紅色)492nm吸收2mol/L硫酸終止反應(yīng)AP的底物硝基苯磷酸酯對(duì)硝基酚(黃色)NaOH終止反應(yīng)

405nm吸收峰磷酸4-甲基傘酮（熒光底物）第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天熒光偏振免疫分析第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天Principleoffluorescencepolarizationemittingdipoleabsorbingdipole

excitationlightpolarizedalongzxzyI

I

detector第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天FluorescencepolarizationimmunoassayAg+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag

HighpolarizedfluorescenceLowpolarizedfluorescence第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天偏振度r第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天時(shí)間分辨熒光免疫分析第48頁,共56頁，2024年