蛋白質工程原理及其在食品工業(yè)中的應用

蛋白質工程原理及其在食品工業(yè)中的應用第一節(jié)蛋白質工程的原理和方法

以蛋白質結構和功能的研究為基礎，運用基因工程的方法，借助計算機信息處理技術的支持，從改變或合成基因入手，定向地改造天然蛋白質或設計全新的人工蛋白質分子，使之具有特定的結構、性質和功能，能更好地為人類服務的一種生物技術。

一、蛋白質工程的概念第2頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

天然的正常構象是蛋白質的最佳狀態(tài)，它既能高效地發(fā)揮功能，又便于機體的正常調控，因而極易失活而中止作用。但在生物體外，特別是工業(yè)化的粗放生產條件下，這種可被靈敏調節(jié)的特性就表現為酶分子性質的極不穩(wěn)定性，導致難以持續(xù)發(fā)揮應有的功能，成為限制其推廣應用的主要原因。如溫度、壓力、機械力、重金屬、有機溶劑、氧化劑以及極端pH值等都會影響它的作用。

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蛋白質工程技術針對這一現狀，對天然蛋白質進行改造改良或全新設計模擬，使目的蛋白質具有特殊的結構和性質，能夠抵御外界的不良環(huán)境，即使在極端惡劣條件下也能繼續(xù)發(fā)揮作用，因而蛋白質工程具有廣闊的應用前景。第4頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

主要包括：分子遺傳學、蛋白質結構功能相關的理論與技術。

分子遺傳學：完整cDNA的克隆技術、DNA序列的快速測定技術、DNA序列推測蛋白質序列的多維程序系統、原核生物及真核生物基因表達過程的調控、基因的定位誘變及隨機誘變理論與技術等。

蛋白質結構功能分析：蛋白質一級結構－氨基酸序列的分析；X光單晶衍射結構分析技術；兩維和三維核磁共振結構分析技術；蛋白質結構數據庫的建立；蛋白質功能的酶學和免疫研究技術；蛋白質分子力場、能態(tài)、自由能等生物物理學研究技術；計算機模擬處理結構分析系統等。

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兩大類理論與技術相互關聯、相互促進，借助其他多類學科的支持，完成對蛋白質分子結構與功能分析、歸類，進一步展開突變蛋白質的分子模擬與預測，實現蛋白質的改造，以及全新蛋白質的分子結構與功能的設計，在計算機模擬的基礎上，進行蛋白質分子的化學修飾、合成的實際操作，驗證分子設計的結果，獲得具有特定結構、性質和功能的目的蛋白質。

第6頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的生物學功能1.催化功能：酶2.調節(jié)功能：激素3.結構功能：皮、毛、骨、牙、細胞骨架4.運輸功能：血紅蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.運動功能：鞭毛、肌肉蛋白7.儲藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神經傳導等第7頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

由于蛋白質是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質有自己獨特的氨基酸順序，所以改變其中關鍵的氨基酸就能改變蛋白質的性質。而氨基酸是由三聯體密碼決定的，只要改變構成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能達到改造蛋白質的目的。蛋白質工程的一個重要途徑就是根據人們的需要，對負責編碼某種蛋白質的基因重新進行設計，使合成的蛋白質變得更符合人類的需要。

第8頁,共96頁，2024年2月25日，星期天天然蛋白質的合成過程DNA（基因）轉錄mRNA翻譯蛋白質基因→表達（轉錄和翻譯）→形成氨基酸序列的多肽鏈→形成具有高級結構的蛋白質→行使生物功能第9頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共96頁，2024年2月25日，星期天思考：對天然蛋白質進行改造，你認為應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現？應該從對基因的操作來實現對天然蛋白質改造，主要原因如下：（1）任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過的蛋白質可以遺傳下去。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳的。（2）對基因進行改造比對蛋白質直接改造要容易操作，難度要小得多。第11頁,共96頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質工程的原理

（一）蛋白質工程的目的

對目的蛋白質進行結構和功能上的設計與改造，以滿足人們特定條件下的需要。以蛋白質結構與功能的研究為基礎，掌握蛋白質活性中心的結構，包括催化中心和調節(jié)中心的空間構象，了解構成中心的各氨基酸殘基及其側鏈基團的位置，再借助計算機圖像與處理系統的模擬進行分子輔助設計，提出對目的蛋白質的改建或構建方案，確定活性中心的氨基酸殘基組成，并輔助設計和預測其結構功能的變化。

第12頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質工程的組成部分

1.蛋白質放大擴增系統由組織提取的少量純化的蛋白質，通常只有0.1-1.0mg。作為出發(fā)蛋白質分子，先解析部分肽段的一級結構，根據遺傳密碼設計并合成相應的同位素標記寡聚核苷酸片段，再由此從基因文庫中調出該蛋白質的克隆化基因，轉入DNA序列分析系統測定DNA序列并克隆化，最后通過表達載體系統擴增蛋白質的量，達到能夠分析出發(fā)蛋白質的結構功能的水平，通常需要蛋白質量為0.1-1.0g。

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2.蛋白質結構功能分析及分子設計系統由上一系統獲得足量的出發(fā)蛋白質后，通過目前已經具備的蛋白質結構分析方法，分析蛋白質的一級結構和空間結構。X光衍射分析晶體蛋白質的結構，而三維核磁共振法研究溶液中的蛋白質結構，同時研究該蛋白質結構與功能的關系，并將結果輸入計算機圖像處理系統和結構處理系統，根據生物物理學原理以及已知蛋白質結構功能數據庫的基本規(guī)律，從結構與功能研究出發(fā)，進行分子結構分析與模擬，進一步輔助設計和功能預測，提出分子的預期性質、改造或構建方案，完成突變蛋白質的分子設計或構建過程。第14頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

3.突變蛋白質的合成表達系統將突變方案通過分子遺傳學方法實施即蛋白質的定點突變技術，改造或構建方案通過合成突變寡聚核苷酸，引入定位突變，或采用其他方法引入突變，并進入克隆系統分離出突變DNA，以此作為模板，引入載體表達系統，擴增表達獲得大量的突變蛋白質。對獲得的突變蛋白質進行結構、性質和功能的分析、測試與判定，如符合分子設計的要求，則獲得目的蛋白質；如不能滿足實際要求，則再由分子設計系統重新指導設計，進入新一輪循環(huán)，最終獲得滿足人們要求的目的蛋白質。第15頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（三）蛋白質工程操作中的問題

1.有關分子遺傳學和基因工程的問題例如更有效的cDNA克隆技術，精確高效的定位突變技術，高效目的基因表達系統等。

2.有關蛋白質結構功能研究的理論和技術例如準確地由一級結構推測高級結構，肽鏈折疊的精確控制，蛋白質的翻譯后修飾，蛋白質結構可變性，分子動力學與蛋白質功能的關系，蛋白質在晶體、溶液以及細胞中的不同存在狀態(tài)及其對蛋白質性質、功能的影響等。

3.一些相關輔助技術例如微量蛋白質的純化鑒定技術、更有效的蛋白質結晶方法、計算機輔助系統的有效性等。第17頁,共96頁，2024年2月25日，星期天三、蛋白質工程的基本步驟

1.分離純化目的蛋白，使之結晶并作X晶體衍射分析，結合核磁共振技術等其他方法的分析結果，得到其空間結果盡可能多的信息。

2.對目的蛋白質功能作詳細的研究，確定它的功能域。

3.通過對蛋白質的一級結構、空間結構和功能之間相互關系的分析，找出關鍵的基團和結構。

4.圍繞這些關鍵的基團和結構提出對蛋白質進行改造的方案，并用基因工程的方法實施。

5.對經過改造的蛋白質進行功能測定，看看改造的效果如何。

6.重復4和5兩個步驟，直到獲得理想的結果。第18頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質工程的基本途徑預期的蛋白質功能設計預期的蛋白質結構推測應有的氨基酸序列找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）第19頁,共96頁，2024年2月25日，星期天討論：某多肽鏈的一段氨基酸序列是：…—丙氨酸—色氨酸—賴氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—…（1）怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應的堿基序列寫出來。首先應該根據三聯密碼子推出mRNA序列，每種氨基酸都有對應的三聯密碼子，只要查一下遺傳密碼子表，就可以將上述氨基酸序列的編碼序列查出來。再根據堿基互補配對規(guī)律推出脫氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多個三聯密碼子編碼，因此其堿基排列組合起來就比較復雜，至少可以排列出16種。第20頁,共96頁，2024年2月25日，星期天GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）mRNA序列脫氧核苷酸序列GCT(或C或A或G)TGGAAA(或G)ATGTTT(或C)CGA(或G或T或C)ACCTTT（或C)TACAAA(或G)（2）確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因（DNA）？確定目的基因的堿基序列后，就可以根據人類的需要改造它，通過人工合成的方法或從基因庫中獲取。第21頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質工程與基因工程的關系

蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學科的綜合科技工程領域。

基因工程是通過基因操作把外源基因轉入適當的生物體內，并在其中進行表達，它的產品是該基因編碼的天然存在的蛋白質。第22頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質工程就是根據蛋白質的精細結構與功能之間的關系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質分子。蛋白質工程自誕生之日起，就與基因工程密不可分。蛋白質工程根據對分子預先設計的方案，通過對天然蛋白質的基因進行改造，來實現對它所編碼的蛋白質進行改造。因此，它的產品已不再是天然的蛋白質，而是經過改造的、具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質。第23頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質工程與酶工程的關系

絕大多數酶都是蛋白質，酶工程與蛋白質工程有什么區(qū)別？

酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用，借助工程學的手段，應用于生產、生活、醫(yī)療診斷和環(huán)境保護等方面的一門科學技術。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產和應用兩方面組成的。酶工程的應用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。第24頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

通常所說的酶工程是用工程菌生產酶制劑，而沒有經過由酶的功能來設計酶的分子結構，然后由酶的分子結構來確定相應基因的堿基序列等步驟。因此，酶工程的重點在于對已存酶的合理充分利用，而蛋白質工程的重點則在于對已存在的蛋白質分子的改造。當然，隨著蛋白質工程的發(fā)展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質工程的一部分。第25頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質的結構

蛋白質分子的生物功能，與蛋白質分子的結構密不可分。決定蛋白質這種特殊生物功能的關鍵因素是它的分子構象。第26頁,共96頁，2024年2月25日，星期天基本組成單位--氨基酸第27頁,共96頁，2024年2月25日，星期天組成生物體蛋白質的20種氨基酸氨基酸英文氨基酸英文賴組脯蘇絲色天冬精LysHisProThrSerTryAspArgLysineHistidineProlineThreonineSerineTryptophanAsparticacidArginine谷纈半胱丙亮酪甲硫(蛋)GluValCysAlaLeuTyrMetGlutamicacidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰天冬酰異亮Gln

AsnIleGlutamineAsparagineIsoleucine第28頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

肽（肽鍵與肽2)

肽鍵就是由氨基酸的α-羧基與相鄰的氨基酸的α-氨基脫水縮合而形成的化學鍵第29頁,共96頁，2024年2月25日，星期天肽（肽鍵與肽3)肽:氨基酸通過肽鍵連結起來的化合物二肽:兩個氨基酸形成的肽三肽:三個氨基酸形成的肽多肽:許多氨基酸形成的肽蛋白質:大多為100個以上氨基酸組成的多肽第30頁,共96頁，2024年2月25日，星期天氨基酸殘基:多肽鏈中不完全的氨基酸。氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現出其分子的不完整。氨基末端：多肽鏈中含有自由α-氨基的一端。簡稱N-端羧基末端：多肽鏈中含有自由α-羧基的一端。簡稱C-端第31頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的一級結構

蛋白質的一級結構是指氨基酸按一定的順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈，也是蛋白質最基本的結構。每一種蛋白質分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級結構，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結構，也就是蛋白質的一級結構決定了蛋白質的二級、三級等高級結構。第32頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質分子的一級結構牛胰島素的一級結構第33頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（1）氫鍵：氫原子與負電性強的原子（如氧、氮等）間形成。對蛋白質分子三維構象的維護很重要。（2）靜電引力：正負帶電基團之間的吸引力。對蛋白質分子三維構象的穩(wěn)定貢獻不是很大，也稱為離子鍵或鹽鍵（3）范德華力：原子團相互接近時誘導所致。它變化多樣，對維持蛋白質活性中心的構象影響很大維持蛋白質空間結構的化學鍵第34頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（4）疏水相互作用：是非極性基團為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質高級結構的重要因素（5）二硫鍵：作用很強，對穩(wěn)定蛋白質構象起重要作用氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力等次級鍵是非共價鍵肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價鍵第35頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質二級結構

二級結構是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結構的構象，是多肽鏈局部的空間結構（構象）主要形式：α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲等第37頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共96頁，2024年2月25日，星期天β-轉角第39頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質分子的二級結構

α螺旋β折疊片β轉角自由回轉第40頁,共96頁，2024年2月25日，星期天三級結構三級結構是指整條多肽鏈在二級結構的基礎上進一步盤曲而成特定格式的三級結構。四級結構很多蛋白質分子是由兩個或兩個以上獨立的、具有三級結構的多肽鏈組成的。這些多肽鏈之間只是通過疏水作用等次級鍵結合成為有序排列的特定的空間結構，形成了四級結構。在四級結構的蛋白質分子中，每個具有三級結構的多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學活性，具有完整四級結構的蛋白質分子才有生物活性。第41頁,共96頁，2024年2月25日，星期天血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2第42頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共96頁，2024年2月25日，星期天四、蛋白質工程的主要研究方法

1.蛋白質的分離純化鑒定方法、結構分析方法、功能研究方法和進行結構改造的分子生物學研究方法在這四類根據蛋白質工程的操作步驟而劃分的主要研究方法中，蛋白質分離純化鑒定方法與生物化學中的常規(guī)方法沒有本質的區(qū)別，是對許多結構、性質相似的一系列突變蛋白質的分離、純化和鑒定，但其難度要大得多，通常需要運用多種高精度的方法才能實現，如親和層析、等電聚焦、免疫沉淀等。

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2.蛋白質功能研究方法必須根據不同種類的蛋白質所具有的不同功能，相應地采用不同的研究方法如對具有催化活性的蛋白質－酶，則用酶學的穩(wěn)態(tài)動力學方法；對抗體則用免疫學方法；其他蛋白質如激素、生長因子、受體類以及核酸結合類蛋白質都有相應的研究方法。所有這些蛋白質功能的研究中，建立一套高效、簡便的蛋白質功能測定方法是成功的關鍵。對特定的蛋白質，如果能夠找到特異專一性的檢測方法，可以極大地提高研究的效率。在分子生物學和蛋白質工程研究中，對不同功能蛋白質特異性檢測方法的研究，也是重要的研究方向之一。

第46頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（一）蛋白質結構分析方法

蛋白質結構分析方法主要是指與研究蛋白質的空間結構有關的理論與技術。主要包括：蛋白質一級結構（即氨基酸序列）的測定方法、蛋白質晶體學、核磁共振法、蛋白質折疊過程研究、蛋白質生物物理研究法以及蛋白質工程的計算機輔助設計與模擬研究等。

1.蛋白質一級結構分析方法蛋白質一級結構研究，即氨基酸序列的測定，其原理是片段重疊、逐級降解、cDNA以及質譜法等幾種，其中片段重疊和逐級降解是最常用的方法。第47頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

2.蛋白質構象研究方法在蛋白質高級結構研究方面，X光衍射和三維核磁共振是蛋白質空間構象研究最主要的分析手段，分別用于對結晶蛋白質和溶液中蛋白質空間構象的研究。X光衍射主要對結晶蛋白質的各向基團的空間排布進行分析，對蛋白質分子的整體空間構架研究作用很大。而三維核磁共振可以直接對水溶液中的蛋白質結構進行分析，溶液中的空間構象更接近于生物體中的自然狀態(tài)，更能反映蛋白質在執(zhí)行功能時的實際構象狀態(tài)。

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3.蛋白質折疊過程研究方法蛋白質折疊過程研究方法，也就是蛋白質折疊機理研究，是蛋白質化學及分子生物學最前沿的課題之一。目前對蛋白質折疊研究主要通過對蛋白質變性、復性過程的熱力學和動力學的研究，以及對折疊中間體的研究而進行。變性、復性過程反映了蛋白質中肽鏈的折疊、卷曲過程。定量地觀察、描述和研究蛋白質變性、復性過程，可以研究肽鏈的折疊過程。熱力學研究反映了過程中的能量狀態(tài)，動力學研究反映了折疊、卷曲過程與時間之間的關系。通過研究折疊中間體來研究折疊途徑也是一種常見的方法。第49頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質從天然狀態(tài)到變性狀態(tài)，或從伸展狀態(tài)折疊到天然構象，是一個漸變過程，其間必然要經過許多中間過渡態(tài)，那些較為穩(wěn)定的過渡態(tài)是折疊過程的限速步驟，這種較為穩(wěn)定的肽鏈構象稱為折疊中間體，它可以有效地反映蛋白質的折疊途徑。盡管絕大多數折疊中間體很不穩(wěn)定，由于三維核磁共振技術的發(fā)展，加上氫交換技術及快速混合技術的成熟，已經可以有效地研究這些中間體。第50頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

4.蛋白質生物物理研究方法及計算機結構模擬研究蛋白質的結構研究方法，除了以上的實驗方法以外，理論分子生物物理學方法也是重要的途徑之一。隨著生物物理、化學以及數學學科的發(fā)展，特別是分子力學、分子動力學的發(fā)展及其與計算機信息處理技術的結合與發(fā)展，利用蛋白質分子內部及其周圍環(huán)境原子之間的作用，以計算機信息處理系統為工具，研究蛋白質的能量、結構、熱力學、動力學性質，進行蛋白質空間結構規(guī)律研究和預測，取得了突破性的進展。理論分子物理學方法的建立，使蛋白質結構的研究擺脫了必須完全依賴實驗過程的傳統模式，開辟了利用計算機模擬研究的新思路，推動了蛋白質結構研究的進程。第51頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（二）分子生物學研究方法基因工程方法，也稱分子遺傳學方法，是一類涉及遺傳物質基因（DNA）的生物學理論與操作技術，包括寡聚核苷酸（又稱為寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目的基因的克隆與分析、目的基因的定位誘變或隨機誘變、目的基因在載體系統中的高效表達等。

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1.寡聚核苷酸片段及基因的人工合成由于DNA自動合成儀的廣泛應用，寡聚核苷酸片段及基因的合成，即DNA的化學合成，現已經成為分子生物學及遺傳工程、蛋白質工程研究中的常規(guī)技術手段之一。無論從合成寡聚核苷酸片段的長度，還是合成的總量來說，都已經達到相當的規(guī)模水平。合成的產物DNA片段也有著多方面的用途，除合成全基因或改造基因這一基本用途外，還可用作探針篩選目標基因，作為引物用于基因的定位誘變或聚合酶鏈式反應（PCR），也可合成連接接頭（1inker）用于基因末端改造等，還可以用于研究基因的調控及基因與其他生物大分子的相互作用。

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2.目的基因的克隆與分析應用于蛋白質工程中目的基因的克隆與分析技術，與常規(guī)基因工程中的方法沒有本質的差別。一般也包含下面幾個基本部分：源DNA的獲得；DNA片段與克隆載體的體外連接；重組后載體引入宿主復制放大建立克隆基因庫；篩選基因庫，獲得目的基因克??；目的基因的結構分析。第54頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

3.目的基因的定位誘變定點突變（site-directedmutagenesis）技術是對已知DNA序列的基因或基因片段中任意指定位置進行突變的技術。它可以按照人們的意愿在指定的位置實現核苷酸的取代、插入或缺失。優(yōu)點：比使用化學因素、自然因素導致突變的方法具有突變率高、簡單易行、重復性好的優(yōu)點，在蛋白質工程中主要應用于需要改變的氨基酸殘基位置可以預先確定的情況下。目前常用的定點突變方法：寡核苷酸引物介導的定點突變、PCR介導的定點突變和盒式突變。第55頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

（1）寡核苷酸引物介導的定點突變原理：用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動DNA分子進行復制，將引物中的突變引入到基因中（圖）。步驟：①將待突變基因克隆到突變載體上。②制備含突變基因的單鏈模板。③引物與模板退火5’端磷酸化的突變寡核苷酸引物，與待突變的核苷酸形成一小段堿基錯配的異源雙鏈的DNA。④合成突變鏈，在DNA聚合酶的催化下，引物以單鏈DNA為模板合成全民的互補鏈，而后由連接酶封閉缺口，產生閉環(huán)的異源雙鏈的DNA分子。⑤轉化和初步篩選異源雙鏈DNA分子轉化大腸桿菌后，產生野生型、突變型的同源雙鏈DNA分子。可以用限制性酶切法、斑點雜交法和生物學法來初步篩選突變的基因。⑥對突變體基因進行序列分析。

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缺點：常常會產生突變效率較低的現象，主要原因是大腸桿菌中存在甲基介導的堿基錯配修復系統所致。進展：近年來這一方法已有了許多改進，如尿嘧啶取代法、缺口雙鏈DNA法、雙引物法等均是利用對大腸桿菌堿基錯配修復系統的抗性來提高突變率的。另外也有人采用改進的質粒作為載體，省去了單鏈模板的制備步驟，節(jié)省了時間。第57頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

（2）PCR介導的定點突變法及其改進—大引物突變法見書

（3）盒式突變原理：利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應序列。這種突變的寡核苷酸是由兩條寡核苷酸組成，當它們退火時，按設計要求產生克隆需要的黏性末端，由于不存在異源雙鏈的中間體，因此重組質粒全部是突變體，突變效率很高。優(yōu)點：如果將簡并的突變寡核苷酸插入到質粒載體分子上，在一次的實驗中便可以獲得數量眾多的突變體，大大減少了突變需要的次數，這對于確定蛋白質分子中不同位點氨基酸的作用是非常有用的方法。特別是對蛋白質中的指定位置的氨基酸殘基，進行一系列不同氨基酸殘基取代以考察取代效果時，非常有效。

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目的基因的定位誘變，與隨機誘變一起都是體外基因誘變最常用的方法。定位誘變法對結構比較清楚的基因或蛋白質較為適合，隨機誘變法則對了解較少的基因或蛋白質比較適用。

隨機誘變法不但對研究對象的基本性質要求較少，還能反過來幫助分析基因或蛋白質的結構，由此思路發(fā)展成分子進化工程技術，大大加快了對生物大分子人工改造的進程。

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4.目的基因的高效表達系統目的基因表達系統中，以大腸桿菌（E.coli）系統最為常用，許多原核和真核生物的基因均能在這一系統中實現高效表達。酵母表達系統是真核生物常見的表達系統，除此之外，還有枯草桿菌系統以及高等真核細胞外源基因表達系統等。在分子生物學方法中出現了一種全新的引入突變的方法，稱為tRNA介導蛋白質工程，它是在目的基因表達過程中引入突變的方法。該方法是借助校正tRNA定點摻入非天然氨基酸，以提供蛋白質結構信息，改進蛋白質檢測與分離方法，甚至賦予蛋白質某些新的特性。

第60頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的體外定向進化屬于蛋白質的非合理設計，它不需要事先了解酶的空間結構和催化機制，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質的突變酶。方法：DNA重組（DNAShuffling）、易錯PCR、隨機定位突變等第61頁,共96頁，2024年2月25日，星期天融合蛋白技術為獲得大量標準融合蛋白而進行的有目的性的基因融合和蛋白表達方法。利用融合蛋白技術，可構建和表達具有多種功能的新型目的蛋白。

雙功能酶（多功能酶）以往研究發(fā)現，在利用基因融合所構建的大的酶分子中，如果用以構成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構成的酶分子各自的酶活性。定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過融合蛋白技術將這兩部分融合在一起，即可構成一個具有獨特構象與功能的蛋白質。第62頁,共96頁，2024年2月25日，星期天五、蛋白質工程的意義與展望

作為第二代遺傳工程，蛋白質工程研究為當代生物技術的產業(yè)化發(fā)展注入了新的生命力。它已經在蛋白質藥物改造、酶工程、抗體工程、分子電子器件和新型醫(yī)學生物材料研制中獲得越來越廣泛的應用。已成功地設計并合成了以α-螺旋和β-折疊層為主體的簡單蛋白質，跨出了人工構建蛋白質的第一步。同時蛋白質工程正在推動一個從預定生物功能到期望的蛋白質結構，再到編碼基因及其表達的反向生物學的發(fā)展。

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21世紀初的20年間蛋白質工程將處于迅速發(fā)展時期，一方面，研究方法和技術將日臻成熟；另一方面，通過與基因工程的密切結合，可望獲得一些有應用價值的成果。但作為以改造通過長期自然進化產生的蛋白質為目標的高新技術，蛋白質工程在實用上尚有一系列嚴重困難有待研究解決，在產業(yè)化的方向上將有艱難的歷程。蛋白質工程是希望與挑戰(zhàn)并存、艱辛與碩果同在的嶄新研究領域。

第64頁,共96頁，2024年2月25日，星期天蛋白質工程自問世以來，短短十幾年的時間，已取得了引人矚目的進展，在醫(yī)學和工業(yè)用酶方面也獲得了良好的應用前景。提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個方面：①延長酶的半衰期；②提高酶的熱穩(wěn)定性；③延長藥用蛋白的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。

第二節(jié)蛋白質工程與食品加工

第65頁,共96頁，2024年2月25日，星期天引入二硫鍵，改善蛋白質的熱穩(wěn)定性

溶菌酶分子：由一條肽鏈構成，并在空間上折疊形成二個相對獨立的結構域，酶活性中心位于二個結構域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個未形成二硫鍵的半胱氨酸由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質分子空間結構的重要共價化學鍵，有如建筑所用的鋼筋一樣，因而能將分子中的不同部位牢固地聯結在一起。因此，提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對或數對二硫鍵。

第66頁,共96頁，2024年2月25日，星期天在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成Asp和Glu，而導致蛋白質分子構象的改變，使蛋白質失去活性。對釀酒酵母的磷酸丙糖異構酶進行誘變改造。這種酶有兩個相同的亞基，每個亞基含有2個Asn，由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。通過寡核苷酸介導的定向誘變技術，將第14位和第78位上的2個Asn分別轉變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。轉化氨基酸殘基，改善蛋白質熱穩(wěn)定性

第67頁,共96頁，2024年2月25日，星期天提高酶的催化活性

酶的催化活性由酶分子上的必需基團決定如對酪氨酸-tRNA合成酶進行定點突變在天然狀態(tài)下，酪氨酸-tRNA合成酶分子內第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖環(huán)上的氧原子形成氫鍵，這個氫鍵的存在影響酶分子與另一底物ATP的親和力。因此，利用定向誘變技術將酶分子第51位蘇氨酸殘基改變?yōu)楦彼釟埢?Pro-51)與ATP的親和力被增加了近100倍，而且最大反應速度亦大幅度提高。第68頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

葡萄糖異構酶（GI），1957年最早在嗜水假單胞菌中發(fā)現其活性，后來又發(fā)現近百種細菌和放線菌能合成該酶，其中絕大多數為胞內酶，只有極少數菌株能分泌胞外酶。葡萄糖異構酶能將D-葡萄糖、D-木糖和D-核糖等催化為相應的酮糖。在體外一定條件下，它也能催化D-葡萄糖轉化為果糖，因而成為工業(yè)上制備高果糖漿（HFCS）的關鍵酶；它還可用于含木聚糖類物質發(fā)酵生產乙醇，是一種具有重大經濟價值的工業(yè)用酶。

一、葡萄糖異構酶（EC5.3.1.5）第69頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

1967年美國成功地進行了GI的工業(yè)化應用，以后西方國家主要的淀粉加工業(yè)都轉向GI技術生產。各國又競相利用生物高技術改造GI的結構、性質和功能，以提高該酶的適應性，擴大應用領域。由于葡萄糖異構酶有較好的耐熱性，結構也較穩(wěn)定，使它成為目前國際上公認的研究蛋白質結構與功能關系，建立完整蛋白質工程技術的最好模型之一。第70頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（一）葡萄糖異構酶的基本性質葡萄糖異構酶能催化D-葡萄糖異構化生成D-果糖，也可將木聚糖異構化為木酮糖，此外還能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖及葡萄糖3、5、6碳的修飾衍生物為催化底物，但是它只能催化D-葡萄糖或D-木糖的α-旋光異構體，而不能催化β-旋光異構體。葡萄糖異構酶的最適溫度一般在70-80℃，最適pH7.0-9.0，微偏堿性，不同種屬來源的酶有一定的差別。葡萄糖異構酶的最適溫度、最適pH值及穩(wěn)定性還受到緩沖液種類、底物濃度、激活劑、穩(wěn)定劑及反應時間的影響。另外二價金屬離子對酶活力、穩(wěn)定性及酶的專一性都有影響。

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各種屬來源的葡萄糖異構酶在結構上都有一定的相似性。其一級結構的同源性隨種屬關系遠近不同而不同。但有40個恒定氨基酸殘基，其中包括14個殘基與酶活性中心有關。葡萄糖異構酶晶體的空間結構一般都是緊密的四聚體，單體相對分子質量約4萬-5萬，單體間符合222點對稱分布。單體由一大一小兩個結構域構成，近N端的主結構域是由8股右手的α/β型桶構成，兩個同軸圓柱中，內柱由8條平行的β-折疊股構成，外柱由8股與β-折疊交替相鄰α-的螺旋構成,α-螺旋與β-折疊構成反平行；C端的小結構域由幾段α-螺旋無規(guī)則卷曲成一個遠離N端的環(huán)狀結構，參與單體內的相互作用及活性部位的構成（圖）。

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葡萄糖異構酶的活性中心位于每個單體平行β桶近C端的口部，是深陷的口袋狀，有兩個二價金屬離子結合位點，與保守的氨基酸殘基側鏈基團以及溶劑中的氧原子形成配位鍵，周圍有一個高度疏水背景區(qū)，構成的氨基酸側鏈不只由一個單體提供，兩個單體相聚成無活性或活性微弱的二聚體，只有形成四聚體時才具有全部酶活。葡萄糖異構酶的催化作用采用的是金屬離子介導的負氫離子轉移機制（圖）。葡萄糖異構酶的基因組織和調控主要是由木糖操縱子控制。由木糖透性酶基因（xylt）、木糖異構酶基因（xyla）、木糖激酶基因（xylb）和調節(jié)基因（xylr）構成木糖操縱子的主要成分。第73頁,共96頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖異構酶最適pH為堿性，在80℃穩(wěn)定，而在堿性條件下，80℃時使高果糖漿焦化產生有害物質，反應只能在60℃進行。采用盒式突變技術將葡萄糖異構酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的區(qū)域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構酶的最適pH值變?yōu)樗嵝?，即可在高溫下進行反應第74頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（二）葡萄糖異構酶的蛋白質工程

直接發(fā)酵生產的GI應用在工業(yè)生產中，已經取得了令人矚目的成功，但仍存在一定局限性，如最適pH值為堿性、高溫下穩(wěn)定性還有待提高等。偏堿性條件下糖不穩(wěn)定易焦化，使總產率下降；高溫條件有利于反應進程的加快和平衡點的向果糖方向移動，因此對GI進行定向改造成為客觀迫切的需求，而蛋白質工程技術，可在研究GI結構－功能關系的基礎上，通過對某些氨基酸的替代和修飾，改變GI的結構性質，改善其工業(yè)應用性能。

第75頁,共96頁，2024年2月25日，星期天表6-1SM1033葡萄糖異構酶定點突變及其性質

突變性質K253R熱穩(wěn)定性小于野生型，比活是野生型1.5倍N184V比活和熱穩(wěn)定性遠低于野生型N184D最適pH值下降了1個單位，pI下降了0.6個單位，酶活為野生型的38.27%A198C最適溫度升高8℃，酶活為野生型的86.95%Q20L最適反應溫度下降5℃，熱穩(wěn)定性為野生型的78%，對底物親和性增強G247D酶活提高33%，最適pH值下降0.6個單位，熱穩(wěn)定性降低G138P熱穩(wěn)定性比野生型提高一倍，最適溫度提高10-12℃，比活與野生型相當G138P/G247D酶活比野生型提高45%，80℃時比G138P更穩(wěn)定第76頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

通過分析比較已知的其他種屬GI氨基酸序列發(fā)現，除高溫嗜熱菌外，該同源位置氨基酸均為Gly，而嗜熱高溫菌同源性部位則為Pro，恰恰是它的熱穩(wěn)定性和最適反應溫度都是最高。Pro較小的轉動自由度以及剛性的吡咯烷環(huán)使得β-轉角或無規(guī)卷曲結構更加穩(wěn)定，從而穩(wěn)定整個蛋白質的空間結構，提高蛋白質的熱穩(wěn)定性。這一現象在其他多種酶中都能發(fā)現，如1,6-寡葡糖苷酶、Trp合成酶、雞腺苷酸激酶等。在蛋白質工程中，用Pro替代其他氨基酸（X-aa→Pro）也有許多應用，如T4噬菌體溶菌酶、絲氨酸蛋白水解酶、中性蛋白酶等。

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葡萄糖異構酶的定點突變蛋白質工程對酶的專一性也有影響，表6-2列出了一些突變體酶對葡萄糖和木糖的催化常數。由表中可見野生型的GI對木糖的催化作用比對葡萄糖大，不同的突變酶其酶的選擇性不同，雙突變W139F／V186T和W139F／V186S的酶底物專一性均有利于葡萄糖的異構化反應。第78頁,共96頁，2024年2月25日，星期天表6-2定點突變對GI底物專一性的影響

突變酶Kcat/Km(min-1nM-1)葡萄糖木糖野生型5.897.2W139Y6.03.2W139F1.513.6V186T9.755.4V186S5.715.9W139F/V186T32.921.6W139F/V186S12.44.0第79頁,共96頁，2024年2月25日，星期天二、凝乳酶

凝乳酶（chymosin）是利用生物工程技術發(fā)酵生產的食品工業(yè)用酶之一，早在1990年就已獲美國FDA批準用于干酪生產，且符合GRAS（GenerallyRecognizedasSafe）標準，無需標示。凝乳酶也是研究蛋白質結構修飾與功能之間關系的良好材料。凝乳酶的蛋白質工程主要集中在對二硫鍵的研究上。不同來源的凝乳酶有不同數目的二硫鍵。牛凝乳酶含有三對，米黑毛霉含有兩列，寄生內座殼菌只有一對。因此不同二硫鍵在凝乳酶中對酶活性的影響是不同的，利用蛋白質工程中的定點突變技術可以了解二硫鍵在結構、功能中的作用。

第80頁,共96頁，2024年2月25日，星期天三、其他分子蛋白質工程（一）胰島素的蛋白質工程

胰島素是一種蛋白質激素，是治療糖尿病的特效藥，具有重要醫(yī)用價值。天然胰島素用于臨床有一些重要缺點，包括作用時效短、進入血流緩慢、長期使用產生抗性、長期保存易變性、供應短缺等。通過對胰島素的蛋白質工程研究，可以獲得上列缺點得到改善的新型胰島素制劑。我國的相關研究人員密切合作，取得下列一系列研究結果。第81頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

1.改造胰島素原連接肽（C肽），從30幾個氨基酸縮短為3個氨基酸，獲得基因工程生產胰島素的高效表達，已進入中試，并獲得國家專利。

2.依據藥用胰島素制劑的精細結構，提出增加次級鍵、穩(wěn)化寡聚體以獲得長效胰島素的原理，通過定向分子設計獲得2種目標產品，作用時效延長8-12h。在0.2nm分辨率測定目標產品的晶體結構，證實分子設計原理的正確性。首次在國內成功地實現從預定性能→分子設計→目標產品制備→改性產品的結構測定的蛋白質工程全循環(huán)，為進一步的研究奠定了基礎，提供了經驗。

第82頁,共96頁，2024年2月25日，星期天3.以速效和高效胰島素為中心，完成定向分子設計12種，獲得4種目標產品，成功地達到預期目標。

4.建立了工程化胰島索結構一功能研究的多種系列，包括長效、速效、高效、高穩(wěn)定、低免疫等改性胰島素，形成了一個比較系統的多方位研究格局，為我國胰島素蛋白質工程的進一步發(fā)展、創(chuàng)新和臨床應用提供了充分條件。

第83頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（二）胰蛋白酶抑制劑

通過蛋白質工程途徑研究慈姑雙頭蛋白酶抑制劑和南瓜族的天花粉蛋白酶抑制劑的結構與功能，取得顯著成績。

1.確認抑制劑的活性中心和二硫鍵的作用。

2.改變抑制劑的專一性，確認專一性相關殘基。

第84頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（三）枯草桿菌蛋白酶

枯草桿菌蛋白酶是廣泛用于洗滌劑工業(yè)中的一種重要酶。蛋白質工程的主要目的是通過酶分子改造獲得抗氧化、穩(wěn)定性并能高表達的堿性蛋白酶。經過幾年的努力，已獲得很好的結果。

1.用定點誘變方法先后通過突變Met222Ala、Gln103Arg、Asp60Asn，使堿性蛋白酶抗氧化性達到95%以上，并提高酶的比活2-3倍。

第85頁,共96頁，2024年2月25日，星期天2.用PCR法對蛋白酶基因進行隨機突變，通過表型篩選得到熱穩(wěn)定的堿性蛋白酶，熱失活半衰期比野生型延長3-6倍。在65℃的高溫下，半失活時間長達82min。由此獲得了既抗氧化又耐熱的堿性蛋白酶。熱穩(wěn)定的堿性蛋白酶基因的DNA序列測定發(fā)現，突變Asn118Ser是熱穩(wěn)定性增加的主要原因，這一結果迄今尚未見有報道。這不僅對該酶應用范圍的擴大具有意義，而且對其結構一功能關系提供了新的了解。這一研究結果已經獲得國家專利。第86頁,共96頁，2024年2月25日，星期天（四）天花粉蛋白的蛋白質工程

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是從括樓塊根中分離純化的一種活性蛋白，屬Ⅰ型核糖體失活蛋白。TCS最早用于中期引產，對治療惡性葡萄胎、滋養(yǎng)層細胞疾病等有較好療效。它還有廣譜的抗病毒作用，能抑制人艾滋病病毒（HIV-1）在受感染細胞中的復制，可望用作抗艾滋病藥物。但天花粉蛋白作為外源毒蛋白，在體內引起免疫應答，導致過敏反應。蛋白質工程試圖通過對TCS進行結構與功能的改造，降低TCS的免疫原性。

第87頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

已經通過測定突變體蛋白與單抗TET結合能力的改變，發(fā)現在殘基173-177之間的突變體明顯降低了與單抗TET的結合能力，從而推測173-177位殘基附近可能是單抗T