微血栓致缺血性心肌病發(fā)病機(jī)制的研究

微血栓致缺血性心肌病發(fā)病機(jī)制的研究微血栓致缺血性心肌病發(fā)病機(jī)制的研究，現(xiàn)在的生活越來(lái)越好了，發(fā)病率卻比起以前來(lái)又更多了點(diǎn)，今天一起來(lái)認(rèn)識(shí)下缺血性心肌病的研究。提高下科普的水平，還是有好處的1材料和方法：1.1動(dòng)物雄性SD大鼠90只體重(250±30)g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)步均按照合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l列執(zhí)行。1.2試劑與器材月桂酸鈉(Sigma，L9755)，大鼠可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(solublethrombomdulin，sTM)ELISA試劑盒(美國(guó)R&D)，中性甲醛固定液(南京化學(xué)試劑公司生產(chǎn))，戊二醛(湖北新景新材料有限公司)MotecDigitalMicroscope成像分析系統(tǒng)(德國(guó)Motec)，透射電子顯微鏡(日本JEOL)，超聲儀(GEVivid7)，L550離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。1.3實(shí)驗(yàn)分組90只大鼠隨機(jī)分成3組：模型組30只，假手術(shù)組30只和正常對(duì)照組30只，各組中隨機(jī)選擇12只進(jìn)行超聲檢測(cè)，另于術(shù)后1、7、28天每組各選6只進(jìn)行組織學(xué)檢查。1.4實(shí)驗(yàn)方法SD大鼠，10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉，常規(guī)備皮，氣管插管連接呼吸機(jī)，右側(cè)臥位固定，于左前外側(cè)第三肋間開胸，逐層剝離進(jìn)入胸腔，分離主動(dòng)脈并用血管夾夾閉主動(dòng)脈后，迅速以微量注射器從主動(dòng)脈根部注射月桂酸鈉(1μg/g)，夾閉20s，松開血管夾，待呼吸心跳穩(wěn)定后逐層關(guān)胸，拔除氣管插管，術(shù)畢腹腔注射80萬(wàn)單位青霉素并于術(shù)后連續(xù)抗炎3日，普通飼養(yǎng)。假手術(shù)組給予同等劑量的生理鹽水替代月桂酸鈉進(jìn)行冠脈內(nèi)注射，正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理，余均同模型組。各組于術(shù)后1、7、28天，分別取6只鼠處死，取材進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。1.5檢測(cè)指標(biāo)1.5.1病理組織學(xué)檢測(cè)：按照時(shí)間點(diǎn)取鼠處死，開胸，取出心臟，修剪去除心耳及主要大血管，中性甲醛固定，石蠟包埋。取左室乳頭肌段心肌，連續(xù)切片，將組織切成4μm厚的切片。每只鼠隨機(jī)取兩張切片進(jìn)行HE以染色觀察微血栓的形成。微血栓指在小于150μm的微血管中，由血小板、纖維素或/和紅細(xì)胞組成，HE染色呈粉紅色，單純的紅細(xì)胞堆積認(rèn)為是血管中殘留的血液，HE染色呈點(diǎn)樣深紅色[7]。同時(shí)取兩張切片進(jìn)行馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)(改良Lendrum法)染色，觀察冠脈微血管原位栓塞組成成分，纖維素呈鮮紅色，肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，膠原纖維呈藍(lán)色，紅細(xì)胞呈黃色，陳舊的纖維素成紫藍(lán)色。1.5.2透射電鏡檢查于術(shù)后第7天，取大鼠左心室組織，4℃條件下制成約1mm3成組織塊，迅速置于2.5%戊二醛固定液中固定24小時(shí)，經(jīng)脫水、浸透、包埋后制成切片，進(jìn)行染色，在透射電鏡下觀察微血管超微結(jié)構(gòu)的改變。1.5.3血漿sTM檢測(cè)各組動(dòng)物均于細(xì)胞移植后1、7、28天取血2ml(n=6/組/時(shí)間點(diǎn))，3000rpm離心10min，收集上清液，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中sTM的濃度。1.5.4心功能檢測(cè)將大鼠麻醉后，備皮，仰臥位固定于檢查臺(tái)上，用10MHz超聲探頭進(jìn)行超聲檢查，每只大鼠記錄3個(gè)心動(dòng)周期以計(jì)算左室收縮末期容積(LVIDs)、左室舒張末期容積(LVIDd)內(nèi)徑的平均值、左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)和短軸縮短率(FS%)。每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)3次，計(jì)算均值為最終的數(shù)值。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS15.0軟件分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間均數(shù)的比較采用單因數(shù)方差分析，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1微血管原位血栓形成模型組HE染色顯示，心肌微血管內(nèi)彌漫分布著由血細(xì)胞、血小板和纖維蛋白構(gòu)成的半透明粉紅色血栓混合物，并可見(jiàn)局部心肌凋亡壞死(圖-1)。馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)(改良Lendrum法)染色則表明，血管內(nèi)微栓塞的成分多由紅色的纖維素和藍(lán)色的膠原所組成(圖-2)。而在假手術(shù)組和對(duì)照組則未見(jiàn)同樣的特征性改變。2.2透射電鏡觀察結(jié)果模型組微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核過(guò)度收縮，核膜有下大面積染色質(zhì)凝聚，形成高密度斑塊，飲泡數(shù)量明顯減少，線粒體絮狀改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接呈增寬斷裂狀，血管腔攣縮狹窄，腔內(nèi)可見(jiàn)膠原成分。假手術(shù)組可見(jiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞核呈梭形結(jié)構(gòu)良好，質(zhì)膜下存在大量飲泡，核內(nèi)細(xì)胞器豐富，核一端相鄰細(xì)胞緊密連接清晰可見(jiàn)，管腔大完整，內(nèi)有大量紅細(xì)胞2.3血漿sTM含量測(cè)定與對(duì)照組相比，術(shù)后模型組在各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清sTM含量明顯增加(P<0.05)，1天時(shí)既有明顯升高，7天時(shí)最高，至28天時(shí)下降至術(shù)后一天水平(表-1)。假手術(shù)組術(shù)組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.4心功能檢測(cè)與對(duì)照組比較，模型組在術(shù)后1天心功能即開始下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);7天時(shí)各項(xiàng)心功能指標(biāo)，模型組與對(duì)照組相比存在明顯降低(P<0.05);28天時(shí)，可見(jiàn)差異繼續(xù)增大(P<0.05)。而在同時(shí)間點(diǎn)假手組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3討論研究結(jié)果表明，冠狀動(dòng)脈微循環(huán)在心肌整體血供體系中扮演了極其重要的角色，引起冠脈微循環(huán)障礙的原因主要可分為原位血栓形成和微栓子栓塞[8]：斑塊中的脂質(zhì)碎片、基質(zhì)成分及內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞脫落、血小板及白細(xì)胞黏附聚集均可造成微小血管栓塞，冠脈血管介入(PCI)治療均可能導(dǎo)致微血管栓塞,使心肌灌注發(fā)生障礙,引起心肌缺血，在即刻或遠(yuǎn)期預(yù)后方面具有重要意義。但并非僅有自發(fā)性的斑塊破裂才導(dǎo)致微血管栓塞,臨床觀察發(fā)現(xiàn),在血管介入治療中,幾乎所有的患者均有致血栓物質(zhì)的釋出[9,10],并可能形成微血管原位血栓的形成,同樣會(huì)導(dǎo)致心肌灌注發(fā)生障礙。因此,防止及減少微栓塞發(fā)生和微血栓的形成具有重要的臨床意義。目前研究認(rèn)為在血栓的過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的完整具有重要的作用[11]，在原位血栓的形成過(guò)程中可能也與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。因而采用向冠脈注射月桂酸鈉的方法來(lái)誘發(fā)微血栓的形成[12]。月桂酸鈉以往常被用于制造外周動(dòng)脈的血栓栓塞模型[13,14]，來(lái)評(píng)價(jià)研究抗血小板及抗血栓類藥物的療效及機(jī)理。由于月桂酸鈉有強(qiáng)烈的內(nèi)皮損傷作用,可造成血管內(nèi)皮的脫落，甚至穿孔;注射1mL(1gPL)月桂酸鈉可以造成下肢動(dòng)脈內(nèi)皮損傷、血栓形成，并進(jìn)一步發(fā)生壞疽[15]。在試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在桂酸鈉的作用下，冠脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)聚集，細(xì)胞器減少，細(xì)胞間緊密連接斷裂增寬，血管腔攣縮狹窄。病理染色則顯示在微血管處存在大量由膠原和纖維素構(gòu)成的血栓形成。以上結(jié)果表明，月桂酸鈉損傷內(nèi)皮細(xì)胞，致使血管的完整性受損，內(nèi)皮下基質(zhì)暴露，誘發(fā)凝血，最終導(dǎo)致原位微血栓的形成?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白(TM)是由由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是蛋白C系統(tǒng)的重要組成成分，其與血酶結(jié)合形成T-TM復(fù)合物而激活蛋白C系統(tǒng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體能加強(qiáng)T-TM活化蛋白C，從而提示TM參與激活蛋白C系統(tǒng)的過(guò)程。而另一方面TM通過(guò)與活化的蛋白C的結(jié)合還可以抑制活化蛋白C的活性，因而TM在凝血和抗凝過(guò)程中具有重要作用，以往對(duì)TM的研究主要集中在凝血和纖溶作用中，而近年來(lái)的研究表明TM可作為某些疾病血管內(nèi)皮損傷的分子標(biāo)志以檢測(cè)血管內(nèi)皮的損傷情況[16,17]。在本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)在術(shù)后1天時(shí)模型組TM含量既有明顯升高，7天時(shí)最高，至28天時(shí)下降至術(shù)后一天水平。這可能與血栓局部炎癥反應(yīng)有一定聯(lián)系?？傊?，通過(guò)向冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射月桂酸鈉的方法，可以成功構(gòu)建大鼠冠脈微血栓的動(dòng)物模型，其機(jī)制與月