醫(yī)學遺傳學實驗指導

醫(yī)學遺傳學實驗指導

實驗守則

一、一般要求

1、預習：學生在實驗課前應認真預習本實驗指導以及教材有關章節(jié)，

必須對該次實驗的目的要求、實驗內(nèi)容、基本原理和操作方法有一定的了

解。

2、講解：教師只對該實驗內(nèi)容的安排及注意事項進行講解，讓學生

有充分的時間按實驗指導的順序進行獨立的操作和觀察。

3、獨立操作與觀察：實驗一般都由學生獨立進行，在實驗中要按操

作程序反復練習，以達到一定的熟練程度。

4、示教：有些實驗備有示教。其目的是幫助學生對某些較難的操作

過程和觀察材料給予演示，學生建立初步認識后，再獨立操作，仔細觀察。

5、作業(yè)：實驗報告必須根據(jù)各人的觀察，以實事求是和一絲不茍的

精神忠實地記錄、分析、綜合。不得抄襲教材或其他同學的報告。實驗報

告一般應于實驗結(jié)束時呈交。它的形式可因?qū)嶒瀮?nèi)容而不同。

6、總結(jié)：實驗結(jié)束后，一般由教師說明該次實驗的主要收獲及今后

應注意的事項。

二、實驗室規(guī)則和注意事項

1、學生上實驗課時必須攜帶教材、實驗指導、實驗報告紙和文具，

進入實驗室要求穿好工作服，按規(guī)定座位入座。

2、實驗開始前要檢查所用儀器、材料、實驗用品是否完好齊全。如

有缺損及時向帶課教師報告，自己不得隨意調(diào)換儀器和實驗用品。

3、實驗時要遵守紀律，聽從教師指導，保持肅靜。有問題時舉手提

問，嚴禁彼此談笑喧嘩或隨意走動，也不得進行和實驗無關的其他活動。

4、實驗時要遵守實驗操作規(guī)程，嚴格按照教師的安排和實驗指導的

要求進行。操作要正規(guī)，觀察要認真仔細，邊做邊看、邊想，及時完成實

驗報告。

5、要愛護儀器、標本和器材設備，注意節(jié)約實驗材料、試劑和水電。

如損壞了儀器或器材應主動報告，說明情況。

6、實驗結(jié)束后，應自覺清理實驗臺面，認真清理好儀器、試劑及其

他用品，放回原處。值日生要負責清掃地面，收拾實驗用品，處理垃圾,

關好水電、門窗后再離開實驗室。

7、實驗課不得遲到、早退或無故缺課。

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實驗一正常人類染色體核型觀察及分析

一、實驗目的

1、熟悉人類染色體的數(shù)目及形態(tài)特征。

2、掌握非顯帶染色體的核型分析方法。

二、實驗原理

人類非顯帶染色體核型分析是染色體研究的一項基本內(nèi)容，它的一般

程序是先利用顯微照相裝置拍攝人類非顯帶染色體的圖象，并放大成染色

體照片，然后按照國際上統(tǒng)一的標準，根據(jù)染色體的長短、著絲粒的位置、

隨體的有無等特征，將人的全套染色體分組編號，并按順序成對地將染色

體剪貼，制成染色體核型圖，然后確定染色體核型，這個過程就稱為核型

分析。利用核型分析可以檢查染色體數(shù)目是否正常，并可發(fā)現(xiàn)較大的染色

體結(jié)構(gòu)畸變以及判定性別等。

ISCN規(guī)定，人的46條染色體中的44條為男女共有的常染色體,

配成22對同源染色體，按1~22編號，根據(jù)染色體的長度和著絲粒的位置

可分為A、B、C、D、E、F、G等7個組，另外還有2條染色體為性染色

體，男性為X、Y,女性為X、XoX染色體屬于C組，Y染色體屬于G組。

三、實驗用品

1、器械：光學顯微鏡、剪刀、鏡子、培養(yǎng)皿、擦鏡紙、膠水或漿糊。

2、試劑：乙酸乙酯、香柏油。

3、材料：正常人染色體標本、中期染色體分裂相照片。

四、實驗內(nèi)容

（一）、正常人染色體標本形態(tài)觀察

取染色體標本，先在低倍鏡下尋找染色體分散良好的中期分裂相，然

后轉(zhuǎn)到油鏡下仔細觀察分析染色體的形態(tài)特征。鏡下可見，中期細胞染色

體都已縱裂成2條染色單體，稱姐妹染色單體，由一個著絲粒相連，每條

染色體以著絲粒為界又分為長、短臂。先計數(shù)染色體總數(shù)，然后識別染色

體長、短臂及隨體，區(qū)分中央著絲粒、亞中著絲粒、近端著絲粒染色體,

再根據(jù)各組染色體的特征予以辨別。

按下述各組染色體的特征對染色體進行分組分析。

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A組：包括1~3號共3對，是最大的一組染色體，第I號為一對最大

的中著絲粒染色體；2號較1號短些，為最大的亞中著絲粒染色體；3號

為次大中著絲粒染色體，是A組中最小的一個。

B組：包括4號和5號染色體，均為亞中著絲粒染色體，短臂較短，

彼此間難于區(qū)別。C組：包括6~12號及X染色體，均為亞中著絲粒染色

體，它們的大小差不多，彼此間難于區(qū)別，其中6、7、8、11及X染色體

短臂較長，9、10、12號染色體短臂較短。X染色體大小介于7~8染色體

之間。

D組：包括13、14、15號三對染色體，均為中等大小的近端著絲粒染

色體，常有隨體處于短臂的末端，彼此間難于區(qū)別。

E組：包括16、17、18號三對染色體，較易區(qū)分，16號為中著絲粒

染色體，17、18號為亞中著絲粒染色體，18號最小，且短臂在E組中最

短。

F組：包括19、20號染色體，是最小的一組中央著絲粒染色體，相互

間很難區(qū)分。G組；包括21、22號和Y染色體，是最小的近端著絲粒染

色體，Y染色體是G組中最大的，且沒有隨體，長臂平行伸展。21、22常

有隨體，22比21要大些。

（二）、顯微照片核型分析

每個人取2張相同的正常人中期分裂相染色體照片，首先辨別核型性

別，一般根據(jù)C組和G組的染色體數(shù)目來判斷，如果C組為16條染色體，

G組為4條染色體，可初步確定該核型是46,XX；如果C組為15條染色

體，G組有5條染色體，則可初步確定該核型為46,XYo然后將小張核型

圖片貼于報告單的上方空白處，以作對照。將大張圖片中的每一條染色體

逐條剪下，放到培養(yǎng)皿中，根據(jù)各組特征，按染色體短臂朝上，長臂朝下，

著絲粒的位置在同一直線上的原則，分別以組、號順序依次排列在培養(yǎng)皿

中（一般先排列

A、B、D、E、F、G組，C組可留在最后排列），檢查無誤后粘貼于核

型分析報告紙上。最后寫出分析結(jié)果、報告者、日期。正常男性核型寫為：

46,XY；正常女性核型寫為：46,XX

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［附表］分裂中期染色體分組編號和主要形態(tài)

組號染色體號形態(tài)大小著絲粒位置鑒別要求

A1-3最大中央、亞中著絲粒要求明確區(qū)

分各號

B4~5次大亞中著絲粒要求不與其

他組相混

C6-12+X中等亞中著絲粒要求按長短

排列

D13-15中等近端著絲粒要求不與其

他組相混E16-18較小中央、亞中著絲粒要求

明確區(qū)分各號F19~20次小中央著絲粒

要求不與其他組相混G21-22+Y最小近端著絲粒

要求21、22與Y區(qū)別

［作業(yè)］

1、參照鏡下繪一個正常人染色體核型快速線條圖，并標明1、2、3、

16號，其余注明組別。

2、每人剪貼分析一個正常人染色體核型照片。

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實驗二人類G顯帶染色體核型分析

一、實驗目的

1.觀察G顯帶染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，了解各號染色體G帶帶型特征。

2.初步掌握G顯帶核型分析方法。

二、實驗原理

人類染色體標本經(jīng)過G顯帶處理后，在每條染色體上可顯示出深淺相

間的條紋，而且有較為恒定的G帶帶紋特征。觀察及分析G帶染色體，可

較為準確的識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細微的結(jié)構(gòu)畸變，從而

提高染色體核型分析的準確性。通常染色體長臂和短臂上被Giemsa染液

深染者稱為深帶，淺染或未被染色者稱為淺帶。在描述每一條染色體上的

帶時，根據(jù)帶紋距離著絲粒的遠近，常使用臂的近端（近側(cè)段）、中部（中

段）、遠端（遠側(cè)段）、末端等名稱。

三、實驗用品

1、器械：光學顯微鏡、剪刀、鏡子、培養(yǎng)皿、擦鏡紙、膠水或漿糊。

2、試劑：乙酸乙酯、香柏油。

3、材料：正常人染色體G顯帶標本、中期染色體G顯帶分裂相照片。

四、實驗內(nèi)容

在G顯帶染色體照片上按每號染色體的特征仔細辨別每條染色體，在

此基礎上用剪刀將照片上的染色體逐條剪下，排列在核型分析報告紙上,

經(jīng)反復調(diào)整，認為準確無誤后用膠水貼上。根據(jù)核型分析結(jié)果，填寫核型、

報告者、報告日期。

附1:各號染色體的帶型特點及鑒別要點

A組：1~3號染色體。

1號染色體：

P：近著絲粒處有兩個深帶，但中部的深帶較寬，遠端著色漸淺。在

處理較好的標本上，遠側(cè)段可見3?4條淺染的深帶。

q：緊貼著絲粒處為深染的次縊痕（呈多態(tài)性），中段和遠側(cè)段各有兩

條深帶，中段兩條深帶稍靠近，第二條深帶染色較濃。

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第1號染色體鑒別并不困難，但如不注意有時會把長短臂顛倒。有兩

個明顯的特征可用以區(qū)別長臂與短臂。其一是短臂遠側(cè)的一半幾乎為淺染

區(qū)；其二是深染的次縊痕位于長臂且緊靠著絲粒。

2號染色體：

P：可見4條深帶，中段的兩條深帶稍靠近些。

q：可見4?7條帶，接近著絲粒的1/3區(qū)段的著色甚淺，其余的遠

側(cè)區(qū)段上，帶紋分布較均勻，著色也深。

3號染色體：

兩臂帶型分布對稱，形似“蝴蝶”，為該染色體的獨有特征，p、q中

部各有一條明顯而寬的淺帶，著絲粒及附近區(qū)段的著色深。

P：近端可見1條深帶，遠端2條深帶較靠近末端，其中遠側(cè)的一條

帶較窄，著色較淺，是鑒別第3號染色體短臂的主要特征。

q：長臂的近側(cè)部和遠側(cè)部一般各有1條較寬的深帶。

B組：4~5號染色體。

4號染色體：

P：中央一條中等著色帶。

q：4~5條分布均勻的中等著色帶，質(zhì)量優(yōu)良的標本中，近中段的兩條

帶又各劃分為兩條深帶。

5號染色體：

P：中央一條中等著色帶，比4號更容易深染。

q：中段可見3條深帶，染色較深，有時融合在一起，呈“黑腰”。遠

端可見1?2條深帶，其中末端的一條深帶著色更濃。

C組：6~12號和X染色體。

6號染色體：

P：中段有一較寬的淺帶，遠端兩條深帶常融合成一條。

q：可有4~6條深帶，近側(cè)的一條緊貼著絲粒，遠側(cè)末端的一條深帶

窄而且著色較淺。7號染色體：

P：末端有一深染帶，形似“瓶蓋”。

q：可見3條分布均勻的著色帶，近側(cè)部和中部的2條帶著色深，遠

側(cè)近末端的一條深帶著色較淺。

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8號染色體：

外形使人感到它的帶紋較為模糊。

P：近側(cè)段和遠測段各有一條著色帶，中段有一條較寬的淺帶，這是

與10號染色體短臂相區(qū)別的主要特征。

q：常見2~3條界線不明顯的深帶，遠端一條染色較深。

9號染色體：

P：遠端可見2條深帶，常融合為1條較寬的帶。

q：有2條明顯的深帶，次縊痕通常不著色且往往是多態(tài)性的；有些

標本上呈現(xiàn)出特有的“頸部區(qū)二

10號染色體：

P：大多不出現(xiàn)明顯的深帶；在較好的標本上，可出現(xiàn)2條淺染的深

帶。q：有明顯的3條深帶，近端一條染色最深。

11號染色體：

P：較長，近中部可見2條深帶（有時融合為1條）。

q：近中部有2條深帶，常融合成一條，與著絲粒之間是一條較寬的

淺帶。12號染色體：

P：中部可見一條深帶。

q：中部由中間寬，兩邊窄的3條深帶組成，常融合成一條較寬的深

帶，與著絲之間有一條淺帶，與11號相比較窄。

X染色體：

大小介于7號和8號染色體之間。

P：中部1條明顯的深帶，猶如“竹節(jié)狀”。近端和遠端為染色較淺的

帶。q：可見4條深帶，近側(cè)部的一條深帶最明顯。

p中部的深帶和q近側(cè)的深帶到著絲粒的距離幾乎是對稱的。

D組：13~15號染色體

13號染色體：

P：短臂和隨體均為深染。

q：可見4條深帶，第1和第4條深帶較窄，色亦較淡；第2條深帶

最寬，第3條次之；有時第2、3和4帶融合在一起。

14號染色體：

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P：短臂和隨體均為深染。

q：4條深帶，近側(cè)部的第一條窄和第二條寬的深帶常融合在一起，近

側(cè)部的第2帶和遠側(cè)部的第4帶特別明顯，這二者之間為一很窄且著色較

淺的帶；在較差的標本上，通常只顯現(xiàn)兩個明顯的深帶。

15號染色體：

P：著絲粒和短臂均為深染。

q：近端有一較窄深帶，中段有一條明顯的深帶，接近末端處有一著

色帶較窄并封口。E組：16~18號染色體。

16號染色體：

P：通常著色較淺，但在較好的標本上可見1?2條著色不很深的帶

q：著絲粒和次縊痕著色均深，近中部有一明顯的深帶，在較好的標

本上，遠側(cè)部可見另1條著色不太深的帶。

17號染色體：

P：淺染，中部通常為一窄的深帶。

q：遠端通常可見一較寬的深帶，在較好的標本上它顯現(xiàn)為2條窄的

深帶，在這條深帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。

18號染色體：

P：淺染。

q：近側(cè)和遠側(cè)各有一條明顯的深帶。

F組：19~20號染色體。

19號染色體：

著絲粒及其周圍深染，p、q均為淺染。在有些標本上長臂近中段可顯

出一條著色極淺的帶。

20號染色體：

著絲粒的染色深。

P：有一顯著的深帶。

q：幾乎為淺染色。

G組：21、22號與Y染色體。

21號染色體：

著絲粒著色淡，其長度比22號染色體短，長臂緊貼著絲粒處為一深

染色的寬帶。8

22號染色體：

著絲粒染色深，比21號染色體長，在長臂上可見兩條深帶，近側(cè)的

一條著色濃且緊貼著絲粒，呈點狀，近中段的一條染色淡，在有的標本上

不顯現(xiàn)。

Y染色體：

p一般不著色；q遠側(cè)1/2處是核型中著色最深的區(qū)段，但其長度變

化不一，有時整個長臂被染成深色。

附2：人類染色體G帶歌謠

一禿二蛇三蝶飄，四像鞭炮五黑腰；六號像個小白臉，七蓋八下九苗

條；十號長臂近帶好，十一低來十二高；十三、四、五一二一，十六長臂

縊痕大；十七長臂帶腳鐐，十八白頭肚子飽；十九中間一點腰；二十頭重

腳飄飄；二十一好像黑葫蘆瓢，二十二頭上一點黑；X染色一擔挑，Y染

色長臂帶黑腳。

［作業(yè)］

分析一張正常人G顯帶核型照片。

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人類染色體G帶核型

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實驗三人類外周血淋巴細胞的

培養(yǎng)及染色體標本制備技術

一、實驗目的

1、熟悉人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)的方法和步驟。

2、掌握人體外周血淋巴細胞染色體標本制備的方法。

3、訓練在顯微鏡下觀察分析染色體的能力。

二、實驗原理

在人類染色體研究中，外周血是運用最多的材料。外周血中的淋巴細

胞在體外培養(yǎng)時因受PHA的刺激轉(zhuǎn)化成能進入有絲分裂的幼細胞；并以紡

錘體抑制劑秋水仙素作用于細胞，使其停滯于分裂中期，從而可制備出處

于有絲分裂中期的染色體標本。

三、實驗用品

1、儀器設備：潔凈工作臺（或無菌工作罩、或無菌操作室）、370c恒

溫培養(yǎng)箱、電冰箱、鼓風干燥機、恒溫水浴鍋、離心機、高壓消毒鍋、分

析天平、顯微鏡等。

2、一般用品：培養(yǎng)瓶、5ml一次性注射器、棉簽、止血帶、5ml刻度

離心管、吸管和滴頭、試管架、粗天平、燒杯、量筒、載玻片（冰濕）、

PH試紙等等。

3、試劑：肝素（500IU/ml）＞秋水仙素溶液（50ug/ml）、RPMI1640.

小牛血清、青霉素、鏈霉素、5%NaHCO3、植物凝集素（PHA）、0.075mol

/LKQ溶液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、雙蒸水、生理鹽水等。

4、材料：人外周血

四、實驗內(nèi)容

（一）、外周血淋巴細胞培養(yǎng)

1、采血接種：用含有肝素的消毒注射器抽取靜脈血，按每培養(yǎng)瓶0.3ml

接種（注意無菌操作）。

2、培養(yǎng)：搖勻培養(yǎng)物后，靜置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約72小時。

3、秋水仙素處理：在終止培養(yǎng)前3~4小時加入秋水仙素溶液，使最

終濃度為0.05~0.4ug/ml培養(yǎng)基，輕搖混勻后，繼續(xù)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱

內(nèi)培養(yǎng)至72小時，以積累更多的中期分裂相。

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（二）、染色體標本的制備

1、收獲：輕搖混勻培養(yǎng)物后，用吸管吸至錐形刻度離心管內(nèi)。平衡

后離心（1000~1200轉(zhuǎn)/分）8?10分鐘，吸去上清液，留沉淀物約0.5ml。

2、低滲：加入37℃預溫的0.075mol/LKCI溶液至4ml,用滴管吹打

混勻，37℃水浴中置20分鐘。

3、預固定：在低滲后，沿管壁緩緩加入1ml新配制的固定液（甲醇：

冰醋酸=3：1）用滴管吹打混勻，離心8?10分鐘，棄上清液，留沉淀物

約0.5ml。

4、固定：加入固定液至5ml,用滴管吹打混勻后以離心8?10分鐘，

棄上清液，留沉淀物約0.5ml。

5、再固定：加入固定液至5ml,用吸管吹打均勻，離心8?10分鐘，

去上清液。視細胞數(shù)量多少而加適量固定液制成細胞懸液。

6、滴片：在滴片前，將清潔載玻片在4℃冰箱冷凍成冰片。用吸管吸

取混勻的細胞懸液在離冰片約15cm距離進行滴片，每片約滴細胞懸液2?

3滴（注意滴片時動作要快，以保證冰片的冰冷程度，且不要重疊），滴片

后斜放、干燥。

7、染色：標本用Giemsa染液染色lOmin（染液用pH6.8的磷酸緩沖

液配制）。自來水沖凈，干后鏡檢。

8、觀察：將制片置于低倍鏡下觀察，選擇染色體分散好、清晰的中

期分裂相，然后換油鏡觀察染色體形態(tài)，在鏡下計數(shù)、分組和性別鑒定,

并能在鏡下準確區(qū)分I、2、3、16、17、18對染色體。

五、注意事項

1、PHA是體外淋巴細胞培養(yǎng)成敗的關鍵問題，PHA對淋巴細胞的作

用，個體差異較大。因此，要考慮它的質(zhì)量和濃度。濃度一般用1%?2%,

每毫升培養(yǎng)液加0.2?0.4ml；濃度過高可能會導致紅細胞凝集。

2、秋水仙素溶液濃度和處理時間。一般最終濃度每毫升培養(yǎng)液0.1?

0.211g為宜，作用時間為3?5h,一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間

有一定的關系。如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如

果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致

形態(tài)特征模糊。

、培養(yǎng)溫度應嚴格控制在士

337℃0.5℃0

4、雙蒸水必須用玻璃蒸鏘器制備，PH應在6?7之間。

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5、低滲步驟極為重要，關系到染色體分散的好壞，因此，低滲液濃

度與低滲的時間應掌握適當。

6、離心機最好用水平式的，速度不宜過快。速度太快細胞團不易打

散，反之分裂相易丟失；固定液應在臨用時新鮮配制，固定一定要徹底、

均勻。若打散不夠，則細胞在玻片上易集結(jié)。

7、若吹打時用力過猛，細胞易破碎，以致染色體數(shù)目不完整；培養(yǎng)

液的PH值應掌握在7.4士0.1左右，PH值偏酸發(fā)育不良，偏堿時細胞出

現(xiàn)輕度固縮。

8、玻璃器皿要十分干凈、無酸，所用試劑以分析純?yōu)楹谩?/p>

9、操作過程應保持高度無菌，嚴防細菌和病毒污染；

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實驗四人類染色體G顯帶標本的制備及觀察

、實驗目的

1、了解人類染色體G顯帶技術方法

2、掌握鏡下各號染色體G帶帶型。

二、實驗原理

人們利用不同的方法和染料處理染色體標本后，可使每條染色體上出

現(xiàn)明暗相間，或深淺不同的帶紋，稱為顯帶技術。上世紀70年代以來，

顯帶技術得到很大發(fā)展，人染色體經(jīng)胰蛋白酶或EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）

等試劑處理后，再用Giemsa染料染色，染色體上出現(xiàn)深淺交替的橫紋，

即染色體的G帶。在眾多的顯帶技術中（Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶、

N帶）,G帶是應用得最廣泛的一種技術。因為G顯帶技術具有設備要求低、

試劑便宜、G顯帶標本穩(wěn)定而易于保存及觀察方便等優(yōu)點。

三、實驗用品

1、器械：恒溫水浴鍋、溫度計、60ml立式染色缸、吸管、滴頭、電

吹風。

2、試劑］：0.02%胰酶溶液、0.4%酚紅溶液、lNNaHCO3>10%Giemsa

染液、pH6.8磷酸緩沖液、0.85%NaCI溶液。

3、標本：外周血培養(yǎng)按常規(guī)法制作染色體標本（白片）。

四、實驗內(nèi)容

（一）、G顯帶標本制備

1、外周血培養(yǎng)按常規(guī)法制作染色體標本，置75℃烘箱烘2~8小時或

置室溫自然老化3~7天左右。

2、將0.02%胰蛋白酶溶液倒入染色缸中，加入0.4%酚紅溶液2滴，

并以lNNaHCO3調(diào)節(jié)PH7.0左右，使顏色為橙色。混勻后，置于37℃水

浴鍋恒溫。

3、將經(jīng)過老化的標本片投入0.02%胰蛋白酶溶液中消化30-60秒。

4、取出已消化的標本片，立即投入磷酸緩沖液中，沖洗殘留的胰酶。

5、用10%Giemsa染液染色10分鐘。

6、自來水沖洗，涼干或電吹風吹干后鏡檢。

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（二）、鏡檢

先在低倍鏡下選擇分散良好、長度適中的中期分裂相，然后轉(zhuǎn)至油鏡

下觀察G帶帶型。選擇帶紋清晰的分裂相進行分析，并在實驗報告紙上繪

出快速線條分裂相，標明各條染色體序號。

五、注意事項

1、G顯帶的好壞，首先取決于染色體本身制片的質(zhì)量，染色體長度要

適中，以早中期為宜，且中期相豐富、分散好，無胞漿背景。若染色體邊

緣發(fā)毛，為顯帶過頭，若染色體上未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足，根據(jù)具體

情況調(diào)整顯帶時間。

2、標本片齡不宜太長，片齡越長，細胞對胰酶處理的抵抗性越強，

片齡過長的標本染色后會導致斑點狀而非帶紋。

3、酶溫度和處理時間需控制好，一般胰酶處理時間不少于30秒。

［作業(yè)與思考］

1、什么是G帶？為什么說G顯帶是應用最廣泛的一種技術？

2、鏡下觀察并繪出一G帶染色體核型圖，在每個染色體旁標明其序

號。

15

實驗五人類染色體C顯帶技術

一、實驗目的

1、學習C顯帶標本制作方法、了解C顯帶技術原理。

2、掌握C顯帶染色體的基本特征。

二、實驗原理

用強堿溶液加熱處理染色體標本使其DNA變性后，再以溫熱的鹽溶液

處理使其復性時，由高度重復DNA序列組成的染色體結(jié)構(gòu)性異染色質(zhì)區(qū)域

的DNA復性速度要明顯快于其它區(qū)域，因而易被Giemsa染液深染，在染

色體上呈現(xiàn)出特有的著絲粒和次縊痕深染區(qū)，即所謂的C帶，也稱為著絲

粒異染色質(zhì)帶。而常染色質(zhì)只能顯示較淡的輪廓。由于人類的第1號、9

號、16號染色體長臂近著絲粒處為次縊痕區(qū)(結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū))，Y染色

體長臂遠端也為異染色質(zhì)部分，因此這些區(qū)域均可顯示出非常明顯C帶，

故此法可以準確鑒別第1號、9號、16號和Y染色體，還用于確定著絲粒

的位置和數(shù)目，配合其它顯帶技術可鑒別部分染色體的結(jié)構(gòu)異常，如雙著

絲粒染色體、環(huán)狀染色體等。不同個體的染色體，其C帶的大小和染色強

度不同，可呈現(xiàn)出多態(tài)性，因此，C帶技術在多態(tài)性研究和分析染色體來

源等方面均有較大的價值。

三、實驗用品

1、器材：玻璃染缸、滴管、燒杯、水浴鍋。

2、試齊！J：0.2NHCL5%Ba(OH)2溶液、2XSSC緩沖液、Giemsa

染液。

3、材料：按常規(guī)法制作的染色體標本。

四、實驗內(nèi)容

(一)、方法1

1、將標本放入已預溫至60℃的5%Ba(OH)2溶液中處理5分鐘。

2、用預熱到600c的自來水沖洗，以除去車貝垢。

3、將標本投入預溫到60oC的2XSSC溶液中溫育30~60分鐘。

4、取出后用自來水沖洗干凈。

5、用Giemsa染液染色10分鐘，水洗，空氣干燥，鏡檢。

16

(二)方法2

1、將制好的玻片放入0.2NHCI中15~30分鐘后用自來水沖洗。

2、浸入預溫至560c的5%Ba(OH)2溶液中處理10~30秒。

3、用預熱到560c的自來水沖洗，以除去車貝垢。

4、將標本投入預溫到60oC的2XSSC溶液中溫育30~60分鐘。

5、水洗后用Giemsa染液染色30-60分鐘。

6、流水沖洗，晾干，鏡檢。

五、鏡檢

由低倍鏡找到合適的細胞分裂相，然后換油鏡觀察。注意1、9、16

號染色體的C帶和Y染色體長臂的遠端帶有明顯的形態(tài)變異性。C帶標本

的帶型特征：

［作業(yè)與思考］

1、什么是C帶？C帶形成的原理是什么？

2、鏡下觀察并繪出一C帶染色體核型圖，標明1、9、16及Y染色體。

17

C顯帶染色體核型圖片

18

實驗六人類異常染色體核型觀察與分析

一、實驗目的

1、掌握人類常見的異常核型的鑒別方法。

2、了解某些重要染色體病的核型特點。

3、了解某些罕見染色體病的核型特點。

二、實驗用品

1、器械：光學顯微鏡、眼科剪、眼科鑲、膠水

2、試劑：香柏油、乙酸乙酯

3、材料：人類異常染色體核型玻片標本、異常核型照片

三、實驗內(nèi)容

（一）、異常核型玻片標本的觀察

1、Down's綜合征患者染色體G帶玻片標本的觀察

取Down's綜合征患者染色體G帶玻片標本，先在低倍鏡下選擇分散

良好、長度適中的中期分裂相，然后轉(zhuǎn)至油鏡下，選擇帶紋清晰的分裂相

進行分析。先進行染色體記數(shù)，然后觀察G帶帶型，并在實驗報告紙上繪

出快速線條分裂相，標明各條染色體序號。

2、其它異常染色體核型標本的觀察（示教）

（二）、異常染色體核型照片分析

隨機抽取一張異常染色體G顯帶核型照片，在顯帶染色體照片上按每

號染色體的特征仔細辨別每條染色體，在此基礎上用剪刀將照片上的染色

體逐條剪下，排列在核型分析報告紙上，找出異常染色體，確定染色體畸

變類型，經(jīng)反復調(diào)整，認為準確無誤后用膠水貼上。根據(jù)核型分析結(jié)果，

填寫核型、報告者、報告日期。

19

(三)、部分異常染色體核型圖片

20

實驗七人類部分遺傳性狀的檢查

一、實驗目的：

通過對人類部分遺傳性狀的檢查分析，初步掌握常見的遺傳性狀的檢

查方法，加深對人類單基因遺傳規(guī)律的理解。

二、實驗原理：

人類的一切正常體質(zhì)特征和生理功能都是遺傳的，同時又是變異的。

人類的性狀遺傳，有些是受單基因控制，表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳；有些是

受多基因控制，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳?，F(xiàn)已查明某些遺傳性狀與某些遺

傳病有特異性關聯(lián)，掌握某些遺傳性狀的特征，可為某些遺傳病的診斷提

供參考。

三、實驗用品：

苯硫胭(phenylthiocarbamide,PTC)1—14溶液，其配制法是：1號為高

濃度PTC(1.3g/L),以后等量對半稀釋至14號。

四、實驗內(nèi)容

（一）、PTC嘗味測試

PTC耳白色結(jié)晶藥物，因含有硫代酰胺基而有苦澀味，對人無毒亦無

副作用。人類對PTC的嘗味能力屬不完全顯性或半顯性遺傳，能嘗出其苦

味的人，稱PTC嘗味者，這決定于顯性基因T的存在。有的人幾乎不能嘗

出其苦味，稱為味盲，這決定純合的隱性基因壯的存在。這對基因位于人

類第7號染色體上。不同民族和個體的嘗味能力不同，在我國人群中漢族

的味盲率約占10%,而廣西壯族味盲率僅約為4%。顯性純合TT者在溶液

濃度在1/750000時即可嘗出苦味，隱性純合tt必須在溶液大于1/24000

才能嘗出其苦味，有人甚連藥物粉末亦嘗不出來。雜合子Tt的嘗味能力介

于顯性純合與隱性純合之間。測試時受檢者從14號逆濃度順序進行嘗味,

用吸管滴02滴在舌根上，測出自己對PTC嘗味能力的閾值。如果對各種

濃度的溶液都嘗不出苦味來，可用少量PTC粉末放在舌根上，再嘗其味如

何？

有調(diào)查表明：純合味盲（tt）者易患結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，原發(fā)性青光眼患者

味盲率占26%,先天愚型中味盲者亦較多。

21

（二卜耳垂遺傳

人群中在耳廓下方有半圓稍隆起的耳殼稱耳垂，有些人有耳垂，有些

人則無耳垂，該性狀受一對等位基因控制。有耳垂為顯性性狀，無耳垂為

隱性性狀。

有資料表明在耳垂上有皺褶的人，常與冠心疾病關聯(lián)。

（三卜達爾文氏結(jié)節(jié)遺傳

人類耳輪邊緣上有一個小突起稱達爾文氏結(jié)節(jié)，一般認為這個突起與

猴類耳殼的耳尖相當。有達爾文氏結(jié)節(jié)為顯性性狀。但在人群中表現(xiàn)不一,

有的僅一個耳朵有些遺傳特征，有的個體具顯性基因，但表現(xiàn)率低，類似

隱性遺傳，也有人認為達爾文氏結(jié)節(jié)與鼻尖厚度連鎖遺傳。

（四八卷舌和翻舌遺傳

按自己的意志將舌的兩側(cè)緣向中線卷曲呈槽狀或筒狀，在人群中能完

成這個動作的，其遺傳方式為顯性遺傳。翻舌即將舌尖伸出口外能后翻而

對著上頜門齒。

舌的活動在人群中可見四種類型：舌能卷不能翻、舌能卷又能翻、舌

不能卷也不能翻、舌不能卷而能翻。舌不能卷而能翻者實屬罕見。研究卷

舌與翻舌遺傳特征與我國人的發(fā)音有關。

（五）、耳垢性狀遺傳

檢查中耳道內(nèi)的耳垢，有些人是干的有些人是濕的。其遺傳方式濕耳

垢是顯性遺傳，而干耳垢則為隱性遺傳。

（六卜前額發(fā)際遺傳

人類有的個體前額發(fā)際處呈V形發(fā)尖，有的為平線。V形發(fā)尖為顯性

性狀。

卜七）、頭發(fā)的直卷性狀遺傳

在人群中大多數(shù)人的頭發(fā)是順直的，直發(fā)的橫截面是圓形，屬于隱性

性狀；有些人在自然狀態(tài)頭發(fā)是卷曲的，卷發(fā)的橫截面是橢圓形，屬于顯

性性狀。

（八八頭發(fā)螺紋遺傳

在頭頂略靠后方的中線處有一螺紋（個別人不止一個）。螺紋的紋路有

兩種方式，有的人是順時針方向，有些人則是逆時針方向。據(jù)認為其遺傳

方式順時針發(fā)螺為顯性性狀，逆時針發(fā)螺為隱性性狀。

22

（九八眼瞼遺傳

主要指雙重瞼和單重瞼。雙重瞼又稱蒙古褶，俗稱雙眼皮，為顯性性

狀。單重瞼又稱單眼皮，為隱性性狀。

（十人拇指關節(jié)遠端超伸展遺傳

有些人拇指的最后一節(jié)能超伸展彎曲，其彎曲度與拇指中軸可達60

度。它屬隱性性狀。

（H^一）、手利遺傳

手利系指人們用手的習慣，左利與右利俗稱左撇于和右撇子。有資料

表明雙親慣用右手，孩子慣用左手頻率為6%；雙親之一慣用左手，孩子

慣用左手頻率為17%；雙親慣用左手，孩子慣用左手頻率為50%；

［作業(yè)］

兩人為一組，相互檢查對方的遺傳性狀特征，并把檢查情況填在調(diào)查

表上。23

24

實驗八性染色質(zhì)標本制作和觀察

一、目的要求：

1、掌握檢查性染色質(zhì)一X染色質(zhì)和Y染色質(zhì)的方法。

2、了解人類間期細胞核中性染色質(zhì)的形態(tài)特征及其在性別決定方面

的意義。二、實驗原理：

女性的兩條X染色體在胚胎發(fā)育16周后，有一條保持轉(zhuǎn)錄活性，而

另一條呈異固縮狀態(tài)，形成X染色質(zhì)（又稱X小體或Barr小體），即女性的

性染色質(zhì)。在間期細胞核中，可被特異的染料染色呈深色而顯示出來，代

表失活了的X染色體。

男性間期細胞核中，在熒光顯微鏡下可見核內(nèi)有一個約0.3Um大小

的熒光小體，系Y染色體長臂末端被熒光染料著色而成，稱為Y染色質(zhì)。

性染色質(zhì)的檢查可作為性別鑒定的依據(jù)和性染色體數(shù)目異常的一種輔助

診斷方法。

三、實驗用品：

1、材料：正常男、女性口腔粘膜細胞和發(fā)根毛囊細胞。

2、器材：顯微鏡、熒光顯微鏡，牙簽、染色缸、載玻片、蓋玻片、

擦鏡紙。

3、試劑：硫堇染液、固定液（甲醇：冰酸醋：3：1）,40%醋酸、7.5N

鹽酸，0.5%鹽酸喳口丫因染液。

四、實驗內(nèi)容：

（-）、X染色質(zhì)制片及觀察：

1、女性口腔粘膜細胞X染色質(zhì)標本制作：受檢者用水漱口后，用牙

簽刮取口腔頰部，將刮起之細胞均勻涂于干凈的載玻片上，立即用固定液

固定10分鐘，晾干，硫堇染液染色10分鐘，水沖洗、晾干、鏡檢。

2、女性發(fā)根毛囊細胞制片：拔下受檢者的頭發(fā)2—3根，將根部帶有

完整毛囊組織的部分置于載玻片中央，加1滴40%醋酸處理5?10分鐘軟

化毛囊，再用牙簽刮下毛囊組織，棄去發(fā)干，均勻涂布細胞，干燥，用固

定液固定15分鐘，晾干，再滴入或浸入7.5N鹽酸中水解10分鐘，用自來

水沖洗，硫堇工作液染色10分鐘，水沖洗，晾干鏡檢。

3、觀察與計數(shù)：用油鏡觀察

（1）形態(tài)：X染色質(zhì)呈深紫色，緊貼核膜內(nèi)側(cè)邊緣，呈饅頭形、三角

球形等狀，為一25

直徑約1-1.5Um邊界清楚的深紫小體。

（2）計數(shù)：選擇核較大，核質(zhì)顆粒少，染色均勻清晰、核膜完整的細胞

核作為計數(shù)，每份標本至少計數(shù)50個細胞X染色質(zhì)出現(xiàn)率。

臨床指標：正常值男性為0—3%,女性為20%以上。

注意：涂布細胞均勻，所計數(shù)細胞要完整，無缺損，無皺褶，核染色

均勻。

X染色質(zhì)數(shù)=*染色體數(shù)-1。

（二/Y染色質(zhì)標本制備及觀察：

男性口腔粘膜細胞或發(fā)根毛囊細胞Y染色質(zhì)標本制片；與上述X染色

質(zhì)標本制備相同。但所用的染料為0.5%鹽酸喳口丫因染液，染色6分鐘后取

出在蒸儲水中放置10分鐘，以除去多余的染料顆粒，不等干，蓋上蓋玻片，

將標本片置熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。用高倍鏡或油鏡觀察均可，但室內(nèi)光

線較暗為好。Y染色質(zhì)在鏡下的特點是在核內(nèi)出現(xiàn)一個較強的熒光點，閃

爍如星星，直徑約0.25um左右，一般位于核的中部或邊緣。每份標本至

少計數(shù)50個細胞Y染色質(zhì)出現(xiàn)率。Y染色質(zhì)在口腔粘膜細胞的出現(xiàn)率一般

為20~30%。但由于個體的差異，出現(xiàn)率常有較大的不同。

注意：1、熒光染料要新鮮配制、現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、染好的標本片不要久放，一般不超過2h。

［作業(yè)］

1、在油鏡下分析計數(shù)50個細胞，并計算X染色質(zhì)的出現(xiàn)率。

2、繪制一口腔粘膜細胞的X染色質(zhì)圖。

思考題：檢查X染色質(zhì)和Y染色質(zhì)有何臨床意義？

X染色質(zhì)示意圖男性口腔粘膜細胞Y染色質(zhì)示意

圖

26

實驗九系譜分析

一、目的要求

1、通過實驗，加深對單基因遺傳病的四種遺傳方式其及特點的理解。

2、掌握系譜的繪制和分析方法，初步掌握遺傳病發(fā)病風險估計的基

本要領。

二、實驗內(nèi)容

系譜分析是在調(diào)查的基礎上，按一定的形式繪成的一個圖式，表示發(fā)

病者家系及家中其他成員的發(fā)病情況。通過家系分析，能獲知遺傳性狀的

遺傳方式和遺傳病發(fā)病的風險，從而對其家屬提出意見和建議。

例一：先證者為女性肝豆狀核變性患者，通過調(diào)查證實：（1）先證者

的大哥、三妹、四弟、五妹以及他們的父母均正常。（2）先證者的父親有

一姐、一弟（即先證者的姑母和叔叔）。（3）先證者的姑母、姑父和他們

的二子一女及先證者的叔、嬸及其二子一女都正常。

1、繪制該家系的系譜。

2、判斷該病屬何種遺傳方式？為什么？

3、寫出家系中患者及其雙親的基因型。

例二：下面是一個家族性高膽固醇血癥的系譜。請分析：

1、該病屬何種遺傳方式？為什么？

2、寫出家系各成員的基因型。

3、假如H2與H1再生一個小孩，他們子女發(fā)病的風險如何？

27

例三：下面是一個苯丙酮尿癥的系譜。請分析：

1、此病屬哪種遺傳方式？為什么？

2、寫出患者及雙親的基因型。

3、ini與m2再生子女的患病風險如何？

4、如果ni2是隨機婚配，其子女患病風險如何？

例四：下面為一個甲型血友病的系譜。請分析：

1、判斷該病的遺傳方式，為什么

2、寫出先證者及其父母和H2的基因型。

3、先證者與正常女性婚配，其子女患病風險如何？可能的基因型是:

4、H1與H2生男孩時，患病風險如何？

例五：下面為一個抗維生素D性佝僂病的系譜。請分析：

1、判斷該病的遺傳方式，為什么？

2、寫出先證者及其父母的基因型。

3、III、II2再生子女的患病風險如何?

4、118、H9和H3、II4若再生子女，其子女的患病風險如何？

28

實驗十人類外周血淋巴細胞

姐妹染色單體交換（SCE）試驗

一、實驗目的：

1、了解SCE實驗的基本原理和設計思路。

2、掌握SCE染色體標本制備方法及SCE的基本特征、記數(shù)方法。

3、探究受試物的致畸作用。

二、實驗原理：

人類生活的環(huán)境中存在著多種有害因子，如物理的（電離輻射、紫外

線、噪聲等）、化學的（氮氧化物、煤煙、汽車尾氣等）和生物的（細菌、

病毒等），對人體健康產(chǎn)生潛在的危險，直接或間接地誘發(fā)基因突變、染

色體畸變等細胞遺傳損傷。體細胞的突變可以導致腫瘤的發(fā)生，而生殖細

胞的突變則可能造成不育、流產(chǎn)、死產(chǎn)及以及使后代獲得遺傳性疾病，使

有害基因在群體中累積，改變?nèi)祟愓w的遺傳素質(zhì)。因而用適當?shù)姆椒▽?/p>

環(huán)境因子的致突、致畸、致癌危險性作出鑒定和評價，進而采取相應的控

制辦法，對避免或減少對人類的危害具有重要的意義?，F(xiàn)已建立了多種短

期誘變試驗方法，其中較為常見的細胞遺傳毒理學方法主要有染色體畸變

試驗、微核試驗、姐妹染色單體交換試驗等等。這些試驗耗資少，周期短，

終點明確，實驗條件易控制，實驗重復性好，結(jié)果可靠。

姐妹染色單體交換（sisterchromatidexchange，SCE）是指在染色體

復制過程中，一條染色體的兩條染色單體在相同位置上發(fā)生同等對稱的同

源片段交換。由于互換是對等的，因而染色體的形態(tài)沒有發(fā)生改變。但SCE

是與DNA的損傷、修復和DNA復制緊密相連的自然過程，如果在DNA復

制過程中發(fā)生DNA損傷和修復，就有可能發(fā)生姐妹染色單體交換。SCE的

發(fā)生頻率可反映細胞在DNA合成期中的受損程度和DNA損傷的重要標志。

在分裂的細胞中，每條染色體由兩條姐妹染色單體組成，每條染色單

體則由一個雙鏈DNA分子構(gòu)成。當細胞在加有5澳脫氧尿喀咤核昔（BrdU）

的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，BrdU取代胸腺啥呢脫氧核糖核昔（TdR）摻入到

新復制的DNA核昔酸鏈中。細胞在BrdU中生長，第一個周期（DNA經(jīng)過

一次復制）后，每條染色體的兩條姐妹染色單體的DNA雙鏈中各有一股鏈

含有BrdU。經(jīng)過第二周期（經(jīng)過兩次復制）后，兩條姐妹染色單體中，一

29

條單體的DNA雙鏈類似第一周期，為單股鏈含BrdU,另一條單體兩

股鏈均含BrdU。兩股都含有BrdU的染色單體螺旋化程度較低，與某些染

色劑的親和力低，用Giemsa染色時著色較淺，而僅有單股含BrdU的單體

著色仍較深，兩條姐妹染色單體顯出深淺不同的顏色，當姐妹染色單體間

發(fā)生同源片段交換時，就可以根據(jù)每條染色單體夾雜著深淺不一的著色片

段加以區(qū)分。當在BrdU中生長三個周期后，50%的染色體因兩條染色單體

的雙股DNA鏈都含有BrdU,因而兩條染色單體都著色淺，50%的染色體因

保留有原來的母鏈，而呈現(xiàn)出一深一淺染色單體。因此，可以根據(jù)每條染

色體的染色單體著色情況區(qū)分不同細胞周期。

30

三、試驗設計

乙基磺酸甲酯（EMS）、環(huán)磷酰胺（CP）、絲裂霉素C（MMC）、黃曲霉

素毒素B1對染色體具有明顯的致畸作用，本實驗可以采用這些化學物質(zhì)

作為陽性對照（終濃度：EMS10-3mol/L,CP2X10-4mol/L,MMC0.02ug/ml,

黃曲霉素毒素Bl10-6moi/L）。以受檢物的溶劑或生理鹽水為陰性對照，對

受檢物進行SCE的測試。受檢物由學生自己確定，同一受檢物可設多組不

同濃度的試驗以觀察是否存在劑量一反應關系。每5~8個學生為一小組（設

陽性對照、陰性對照各一人和不同劑量試驗組各一人）。受檢物的試驗劑

量一般包括不損傷細胞生長潛力的最高劑量、一個次高劑量和一至三個較

低劑量，但最高劑量不能超過5mg/ml。同一受檢物可做多組重復試驗以

減少試驗誤差。受檢物可用適當?shù)娜軇┤芙猓軇┑慕K濃度應盡可能小

于5%。實驗前，先由學生劃分小組，設計實驗方案，報經(jīng)教師確認后實

施。

四、實驗用品

1、器材：水浴鍋、紫外燈、溫度計、擦鏡紙、培養(yǎng)箱、離心機、離

心管、培養(yǎng)瓶、顯微鏡、滴管

2、試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、2XSSC緩沖液、Giemsa染液、BrdU溶

液（500ug/ml）、甲醇、冰醋酸、0.075MKCL秋水仙素溶液（12.5Ug/ml）.

PH6.8PBS＞陽性對照物、陰性對照物。

3、材料：人外周血、受試物（不同濃度溶液）

五、實驗內(nèi)容

1、外周血培養(yǎng)及染色體標本片制備

按常規(guī)方法采血、接種，陽性對照組加入適當濃度的陽性對照物0.5mL

陰性對照組加入0.5ml生理鹽水或受檢物溶劑，各試驗組加入不同濃度受

檢物溶液0.5ml,置37℃恒溫培養(yǎng)24h后，各加入BrdU（終濃度為10ug

/ml）,繼續(xù)避光培養(yǎng)48小時后，按常規(guī)方法收獲、制片。制好片后，置

37℃溫箱中老化3?10天。

2、姐妹染色單體差別染色

將標本片放入培養(yǎng)皿中，加2XSSC數(shù)滴于玻片上，蓋一張擦鏡紙，

以濕潤擦鏡紙為宜，并在培養(yǎng)皿中加入2XSSC使之浸在玻片底面，把培

養(yǎng)皿置于預溫75。。水浴鍋平板上，距30W紫外燈管5cm,照射30分鐘，

其間滴加數(shù)次2XSSC,勿使擦鏡紙干燥。用Giemsa染液染色10分鐘，自

來水沖洗、晾干即為SCE標本。

31

3、SCE觀察計數(shù)

鏡下（油鏡）觀察中期分裂相時、注意區(qū)分各細胞周期分裂相的染色

特點：①染色體的兩個單體均為深染的細胞記為第一周期的細胞；②染色

體的兩個單體染色一深一淺的細胞為第二周期細胞；③部分染色體的兩個

單體染色都為淺色的細胞為第三周期的細胞。選擇染色體分散良好、長

度適中、輪廓清晰、數(shù)目完整、分化良好的的第二周期的分裂相進行計數(shù)。

人體姐妹染色單體交換（SCE）的計數(shù)方法：

①凡是在染色單體端部出現(xiàn)互換，記為1次交換；②在染色單體中間

出現(xiàn)互換，記為2次交換；③如果在著絲粒處發(fā)生交換，需判明是否為扭

轉(zhuǎn)，不是扭轉(zhuǎn)的為著絲粒部位交換，記為1次交換。每一份標本至少需要

計數(shù)20~50個細胞的染色體，計算SCE平均交換頻率。

SCE平均交換頻率（次/細胞）=交換總次數(shù)/細胞數(shù)

六、結(jié)果統(tǒng)計分析

分別統(tǒng)計本班各試驗組、陽性對照組、陰性對照組的SCE平均交換數(shù)

的試驗結(jié)果，用統(tǒng)計學方法進行檢驗。以SCE頻率的增加作為劑量函數(shù),

根據(jù)高于本底或自發(fā)水平的統(tǒng)計學上的顯著增加來解釋。當受試物誘發(fā)的

SCE平均交換數(shù)較陰性對照有統(tǒng)計學意義的增加，并有劑量一反應關系時,

說明受試物有誘發(fā)SCE作用，可進一步分析受試物的細胞遺傳毒理性質(zhì)，

并以試驗組為單位寫出實驗報告或研究論文。

32

實驗H—染色體畸變試驗

一、實驗目的：

（1）用細胞遺傳學方法檢測人或?qū)嶒瀯游锏耐庵苎?、骨髓細胞染?/p>

體畸變率的增加，以評價受試物的致突變性。

（2）了解染色體畸變的可能原因，掌握染色體結(jié)構(gòu)畸變的特點，訓

練識別畸變?nèi)旧w的能力。

二、實驗原理

物理、化學、環(huán)境污染物均可導致染色體的直接或間接斷裂。斷裂后

的斷片、游離片段彼此間互相重接，便產(chǎn)生各種類型的染色體畸變。致畸

因素作用于細胞周期的G1期時，引起染色體型畸變，而作用于S期或G2

朝時，則引起染色單體畸變，作用于M期時，則有可能導致染色體數(shù)目畸

變。在細胞分裂中期可以觀察到這些染色體的畸變，哺乳動物的骨髓細胞

一直保持細胞分裂活動，外周血細胞培養(yǎng)物中加入適量的PHA,也可以使

淋巴細胞從GO期轉(zhuǎn)化進入細胞增殖周期，利用秋水仙素的處理，可以獲

得大量良好的中期染色體分裂相，在顯微鏡下就可以對染色體畸變進行分

析和統(tǒng)計，從而可以對致畸因素的影響作出分析。

三、實驗用品

1、器材：顯微鏡、離心機、普通天平、恒溫培養(yǎng)箱、注射器，解剖

剪、解剖刀、載玻片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等。

2、試劑：2mg/ml環(huán)磷酰胺、Brdu、小牛血清、肝素、RPMII640培養(yǎng)

基、甲醇、水醋酸、0.075MKCI低滲液、PH6.8磷酸緩沖液、Giemsa原

液、生理鹽水。

3、材料：小白鼠、人外周血

四、實驗內(nèi)容

（-）小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗

1、實驗設計：選擇成年健康小白鼠（大鼠）隨機分組，至少3個劑

量組，另設陽性對照組和陰性對照組，每組1只動物。可設多組平行組以

增加試驗次數(shù)，減少實驗誤差。

2、處置：陽性對照組可采用環(huán)磷酰胺（50ug/g體重），陰性對照組為

溶劑對照。分別用陽性、陰性對照物和受試物對小鼠進行腹腔注射。也可

用經(jīng)口灌胃方式，共染毒兩次，33

間隔24小時。于第二次染毒后6小時處死動物，處死動物前4小時

腹腔注射秋水仙素（注射劑量按4ug/g體重）。

3、取材：用頸椎脫臼法處死小鼠，取出完整的股骨，用紗布擦去骨

上殘肉，再用生理鹽水洗滌。

4、收集細胞：剪去股骨兩頭，用注射器吸入低滲液約1ml,插入骨髓

腔中，反復沖洗腔內(nèi)骨髓入離心管中，直到股骨骨髓變白為止。

5、低滲：加入預熱低滲液至4mL用吸管吹打混勻，置37℃恒溫水

浴鍋內(nèi)低滲30分鐘。

6、預固定:加入1ml甲醇、冰醋酸固定液，用吸管吹打混勻，以lOOOrpm

離心8分鐘，去上清液。

7、固定：加入固定液至5ml,用吸管吹打混勻，以lOOOrpm離心8

分鐘，去上清液。按本方法再固定一次。

8、滴片：在離心沉淀物中加入少量固定液，混勻，制備細胞懸液，

滴片。

9、染色：用姬姆薩染液染色10分鐘，用自來水沖洗，晾干。

10、觀察：選擇分散良好的中期分裂相，在顯微鏡油鏡下觀察100個

細胞，記錄畸變類型。小鼠染色體均為端著絲粒染色體，2n=40,大白鼠

染色體有中央、亞中和近端著絲粒染色體三種，2n=42。

(-)外周血淋巴細胞致染色體畸變實驗

按常規(guī)方法采血、接種，按組分別加入陽性對照物、陰性對照物和受

試物，按常規(guī)方法培養(yǎng)、收獲、制片，用姬姆薩染液染色后觀察染色體畸

變。也可以進行G帶等顯帶后分析。對每一處理組選100個分散良好的中

期分裂相進行染色體畸變分析，觀察染色體結(jié)構(gòu)的異常及多倍體的出現(xiàn)率。

五、結(jié)果評價

計算畸變細胞出現(xiàn)率和染色體畸變率，再統(tǒng)計各平行組的數(shù)據(jù)。所得

各組的數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學方法進行處理，以評價試驗組與對照組之間是否有明

顯差異。受試物誘發(fā)的染色體畸變的出現(xiàn)率較陰性對照有統(tǒng)計學意義的增

加，并有劑量一反應關系時，記為陽性，同時標明異常細胞出現(xiàn)的頻度和

種類。以實驗小組為單位寫出實驗報告或研究論文。

畸變細胞出現(xiàn)率（％）=（各種畸變類型細胞數(shù)/分析總細胞數(shù)）X100

染色體畸變率（％）=（畸變?nèi)旧w數(shù)/染色體總數(shù)）X100

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附：染色體畸變類型

（一）染色體數(shù)目畸變

1、非整倍性：染色體數(shù)目非成倍性地增加或減少。數(shù)目減少一條或

幾條的，稱為亞二倍體，數(shù)目增加一條或幾條的，稱為超二倍體。

2、多倍體：染色體數(shù)目成倍性地增加。如三倍體、四倍體等。

3、內(nèi)復制：一個細胞核內(nèi)發(fā)生兩次連續(xù)的染色體復制，每條染色體

產(chǎn)生四條染色單體，它們彼此兩兩相靠在一起，成為染色體核內(nèi)復制。

（二）染色體結(jié)構(gòu)畸變

在同一部位兩條染色單體發(fā)生斷裂和重接，稱為染色體型畸變。如果

只有一條單體發(fā)生斷裂或互換，稱為染色單體畸變。

1、染色體型畸變：

（1）染色體斷裂：一個染色體兩條染色單體的同一座位因染色質(zhì)損

傷而間斷，其斷裂的長度大于染色單體的寬度時稱為染色體斷裂。

（2）無著絲粒斷片：斷裂后的片段離開原位稱為無著絲粒斷片。

（3）雙著絲粒染色體：是具有兩個著絲粒的染色體。

2、染色單體畸變:

指在某一染色體的一條單體上發(fā)生的畸變。

(1)染色單體斷裂：位于一條染色單體上的一種具有清楚的非線性

節(jié)段的間斷。其斷裂的長度小于或等于染色單體的寬度時稱為染色單體斷

裂。

(2)染色單體缺失：指某一染色體的單一染色單體的某一帶型順序

的缺失。

(3)三射體和四射體：在兩條染色體的染色單體之間斷裂而后互換

重接而成。在此過程中，如果有三個臂參予，這種圖象稱三射體，如果有

四條臂參與時稱四射體。

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微核測定試驗

一、目的要求

1、掌握各類細胞微核標本制備方法。

2、熟悉微核的形態(tài)特征。

3、了解微核的發(fā)生機制及微核檢測技術的用途。

二、實驗原理

微核(micronucleus)是細胞核外的染色質(zhì)小體，其直徑一般比主核小

1/3以上。微核的形成與染色體畸變或損傷有密切關系，當分裂細胞受到

有害理化因子的作用時會使染色體受到損傷，產(chǎn)生無著絲粒的染色體斷片;

另一方面，細胞在紡錘體毒劑的作用下會發(fā)生紡錘體機能障礙，產(chǎn)生落后

的染色體，到分裂末期因缺乏紡錘絲的牽引而無法進入子細胞的核內(nèi)。這

些染色體斷片或落后染色體往往在分裂的末期仍游離、滯留在細胞質(zhì)中,

濃縮形成一至幾個次級核，其嗜色性與主核一致，故稱微核。微核在骨髓

和外周血液的有核細胞中均可見到。但是，在這類只有少量胞漿的有核細

胞中，微核常難以與正常枝葉及核的突出物相鑒別。而在無核的骨髓嗜多

染紅細胞的胞漿中，微核卻十分易于辨認。70年代初，Matter和Schmid

首先用嚙齒類動物骨髓細胞微核率來測定懷疑有誘變活力的物質(zhì)，并建立

了微核測定法，微核標本制作簡便、靈敏度及可信度高，微核率的大小和

誘變劑的劑量是呈正相關，故常用來評價理化因子對染色體損傷危害，可

根據(jù)細胞的微核率來判斷某些理化因子對染色體的損傷程度以及對遺傳

物質(zhì)致畸效應的大小。目前，國內(nèi)外不少部門已把微核測試法應用在輻射

防護、輻射損傷、化學誘變劑研究、新藥毒理試驗、染色體疾病及癌癥前

期診斷等方面。該方法已成為遺傳毒理實驗的一種常用的細胞遺傳學方法。

實驗十二小鼠骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核測定

1、實驗設計：

一般選用體重為25?30g的小鼠，雌雄皆可。本實驗采用環(huán)磷酰胺為

陽性對照，陰性對照采用生理鹽水或受試物溶劑，受試物可設三個劑量組，

可設多組重復以減少實驗誤差。劑量的選擇很重要，若劑量太低，會漏掉

陽性物；若劑量太高，可致動物死亡，或因?qū)撬瓒拘宰饔锰珡姡率故?/p>

多染紅細胞受到抑制，難以獲得正確的結(jié)果。一般取受試動物LD5036

的1/2、1/5、1/10、1/20等劑量，以求獲得微核的劑量一反應關系曲

線。

2、實驗用品

(1)器材：離心機、顯微鏡、計數(shù)器、注射器、解剖器械、紗布、

離心管、吸管。

（2）試劑：2mg/ml環(huán)磷酰胺溶液（CP）、小牛血清（FCS）、甲醇溶

液、Giemsa染液、PH6.8的PBS。

（3）材料：2?3月齡健康小鼠。

3、實驗步驟：

（1）染毒：采用腹腔注射或經(jīng)口染毒。常用經(jīng)口灌胃方式，一般采

用30小時染毒法，即兩次給毒間隔24小時，第二次給毒后6小時取材。

環(huán)磷酰胺溶液終濃度50口g/g體重。

（2）取材：以頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩根股骨，剔凈肌肉，用

紗布擦掉附在