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文檔簡介

主講老師：邢煜騫目的基因的獲取目的基因的來源在基因工程設(shè)計和操作中，被用于基因重組、改變受體細(xì)胞性狀和獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。目的基因的生物來源：真核生物染色體基因組原核生物染色體基因組質(zhì)粒基因組病毒（噬菌體）基因組線粒體基因組葉綠體基因組目的基因的獲得直接法（直接分離法、鳥槍法）

---原核生物基因組

間接法（cDNA文庫克隆、RT-PCR）---真核生物基因組反轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫克隆）cDNA是指互補(bǔ)(有時稱拷貝)DNA。特指在體外經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈。與平常我們所稱謂的基因組DNA不同，cDNA沒有內(nèi)含子而只有外顯子的序列。分離純化含目的基因的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列,可以從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄生成該蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。cDNA克隆示意圖DNA聚合酶ImRNA

反轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1反轉(zhuǎn)錄法mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成細(xì)胞內(nèi)RNA的組成和含量：

DNA：95%核內(nèi)，5%細(xì)胞器

RNA：75%細(xì)胞質(zhì)，10%核內(nèi)，15%細(xì)胞器

rRNA80~85%；tRNA10~15%；mRNA2~5%反轉(zhuǎn)錄法真核細(xì)胞mRNA的特點及分離純化方法3′-polyA（20~250AAA）-oligo（dT）mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成反轉(zhuǎn)錄法cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3’-polyA，所以可用寡聚(dT)作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，合成cDNA鏈。cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以第一鏈為模板，從發(fā)夾結(jié)構(gòu)開始合成。DNA聚合酶Ⅰ-----合成cDNA第二鏈核酸酶S1-----切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成cDNA文庫的優(yōu)越性以mRNA為模板，排除了內(nèi)含子的干擾；對于RNA病毒，cDNA克隆是唯一辦法篩選簡單易行出現(xiàn)假陽性的概率較低小結(jié)對于真核生物基因組，

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