第9章 DNA序列分析課件

第九章DNA序列分析第一節(jié)Maxam-Gilbert化學(xué)降解法第二節(jié)Sanger鏈終止法第三節(jié)DNA片段序列測定的策略第四節(jié)核苷酸序列的生物信息分析第9章DNA序列分析DNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。確定DNA雙股鏈上每一個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)單元或堿基的確切順序。DNA序列的正確測定，是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能分析，繪制基因圖譜、轉(zhuǎn)基因檢測等方面工作的重要前提。同時(shí)DNA測序技術(shù)為快速、簡捷分析蛋白序列及結(jié)構(gòu)提供了工具。第9章DNA序列分析DNA測序的發(fā)展：1953年，Watson和Crick推導(dǎo)出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；1954年，Whitfeld發(fā)明化學(xué)降解測序法；1972年，Berg開發(fā)DNA重組技術(shù)；1975年，Sanger發(fā)明加減測序法；1977年，Sanger發(fā)明雙脫氧測序法；1986年，第一臺半自動測序儀出現(xiàn)；2000年，Drosophila全基因組測序完成。第9章DNA序列分析DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學(xué)降解法。20實(shí)際80年代中期，測序儀出現(xiàn)。發(fā)展至今，自動化測序已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國peabi公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號。第9章DNA序列分析最早的測序技術(shù)測序技術(shù)最早可以追溯到20世紀(jì)50年代，早在1954年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測序技術(shù)的報(bào)導(dǎo)，即Whitfeld等用化學(xué)降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。第一代測序技術(shù)誕生1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生。此后，在Sanger法的基礎(chǔ)上，80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號接收器和計(jì)算機(jī)信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀。另外，90年代中期出現(xiàn)的毛細(xì)管電泳技術(shù)使得測序的通量大為提高。除此之外，這一時(shí)期還出現(xiàn)了一些其他的測序方法，如焦磷酸測序法（pyrosequencing）、連接酶測序法（sequencingbyligation,SBL）、雜交測序法（sequencingbyhybridization,SBH）等。第9章DNA序列分析第二代自動測序技術(shù)盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測序技術(shù)誕生了。與第一代技術(shù)相比，第二代測序技術(shù)不僅保持了高準(zhǔn)確度，而且大大降低了測序成本并極大地提高了測序速度。使用第一代Sanger的測序技術(shù)完成的人類基因組計(jì)劃，花費(fèi)了30億美元巨資，用了三年的時(shí)間；然而，使用第二代SOLiD的測序技術(shù)，完成一個(gè)人的基因組測序現(xiàn)在只需要一周左右的時(shí)間。由于第二代測序技術(shù)產(chǎn)生的測序結(jié)果長度較短，因此比較適合于對已知序列的基因組進(jìn)行重新測序，而在對全新的基因組進(jìn)行測序時(shí)還需要結(jié)合第一代測序技術(shù)。第9章DNA序列分析第三代基因組測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)單分子速讀據(jù)《自然》雜志網(wǎng)站2月8日報(bào)道，在美國佛羅里達(dá)州馬可島召開的“基因組生物學(xué)與技術(shù)進(jìn)展大會”上，來自加利福尼亞門洛帕克市的太平洋生物科技公司(PacificBiosciences)介紹了其研制的第三代基因組測序儀，該測序儀實(shí)現(xiàn)了一次標(biāo)記一個(gè)分子式的單分子速讀。第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析序列測定的技術(shù)

雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術(shù)方法:第9章DNA序列分析第一節(jié)Maxam-Gilbert化學(xué)降解法

化學(xué)降解法：人們用專一性作用于A、T、G、C堿基的化學(xué)藥劑分別處理經(jīng)內(nèi)切酶切割而成的一定長度DNA片段，通過控制反應(yīng)時(shí)間，既可獲得分別以A、T、G、C為結(jié)尾的四組由所有可能長度核苷酸片段組成的DNA片段群。除了要研究與DNA的高級結(jié)構(gòu)、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)性采用化學(xué)降解法外，對于單純以測序?yàn)槟康牡膶?shí)驗(yàn)，普遍采用后面所講的酶促合成法。

第9章DNA序列分析堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應(yīng)。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。第9章DNA序列分析G反應(yīng)：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應(yīng)：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應(yīng)：肼（低鹽）C反應(yīng)：肼（高鹽）測定DNA長度~250bp。第9章DNA序列分析化學(xué)裂解法測定DNA的核苷酸序列第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第二節(jié)Sanger鏈終止法1977年Sanger設(shè)計(jì)了一種通過DNA復(fù)制來識別4種堿基的方法，進(jìn)行DNA序列測定，即雙脫氧鏈終止法。Sanger法獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理在模板指導(dǎo)下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長，合成出新的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。

第9章DNA序列分析與PCR反應(yīng)類似。反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應(yīng)過程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法第9章DNA序列分析Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般3~4：1)。第9章DNA序列分析*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較H第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析二、雙脫氧終止法測序反應(yīng)體系：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)第9章DNA序列分析Sanger法DNA測序的試劑①引物：通常由20-23個(gè)堿基構(gòu)成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)②模板③

DNA聚合酶④

2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸（2’,3’-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP）⑤

dNTP三、測序反應(yīng)的種類①引物標(biāo)記法(Dyeprimerreactions)②終止物標(biāo)記法(Dyeterminatorreactions)第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.第9章DNA序列分析Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析測序過程:1.模板與引物雜交2.引物的延長和合成阻斷四個(gè)試管分別加入：DNA聚合酶、dNTPs、標(biāo)記引物終止劑不同：ddA、ddG、ddC、ddT四個(gè)試管中所有產(chǎn)物是一系列長度只差一個(gè)核苷酸的聚合鏈3.電泳：ACGT次序，高壓電泳4.放射自顯影得到直讀圖象第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快第9章DNA序列分析ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP與dNTP的比例，比例高時(shí)，得到較短的產(chǎn)物；

第9章DNA序列分析GelElectrophoresis

DNAFragmentSizeDeterminationDNA帶負(fù)電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關(guān)Sanger第二步：熒光檢測第9章DNA序列分析除核苷酸序列文本文件外，全自動測序儀還提供曲線圖。第9章DNA序列分析DNA片斷序列測定的策略測定未知序列的DNA片斷一次測序結(jié)果有長度限制（﹤1000bp)

通用引物指導(dǎo)未知序列的測定引物步移隨機(jī)克隆測序缺失克隆測序第9章DNA序列分析通用引物指導(dǎo)未知序列的測定根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)通用引物測定待測DNA片斷第9章DNA序列分析引物步移策略將待測DNA片斷克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進(jìn)行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前要預(yù)先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行測序。定向缺失克隆策略、染色體步查法等。第9章DNA序列分析鳥槍測序法(shotgunsequencing)：隨機(jī)克隆測序

將待測的DNA片段隨機(jī)打斷并構(gòu)建隨機(jī)重疊克隆文庫，然后通過通用引物測定每個(gè)克隆中的待測DNA序列。當(dāng)這些已測序列的數(shù)量達(dá)到一定程度后，相當(dāng)于待測DNA片斷的每一部位的序列也就被測定出來了，通過這些所測序列之間的重疊部分，最終可將整個(gè)DNA片斷的序列拼接出來，這樣的測序策略稱為隨機(jī)克隆測序。

第9章DNA序列分析將DNA大片段切割成小片段的三種方法：限制性內(nèi)切酶酶切超聲波處理

DNA酶I降解(加Mn2+)第9章DNA序列分析鳥槍法測序的缺點(diǎn)隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復(fù)測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤。第9章DNA序列分析完整基因組的測序過程一般包括三個(gè)步驟：（1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosome）克隆、細(xì)菌人工染色體BAC（BacterialArtificialChromosome）克隆等；（2）利用鳥槍法（ShotgunStrategy）測定每個(gè)克隆的序列；（3）序列拼裝和注釋：當(dāng)?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進(jìn)行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，如基因、調(diào)控元件、重復(fù)區(qū)域等，進(jìn)而對序列的生物學(xué)特性進(jìn)行注釋。

基因組測序第9章DNA序列分析DNA全序列切成小段小段和載體結(jié)合結(jié)合后進(jìn)行測序第9章DNA序列分析MapfragmentsSequenceoverlapping

fragmentsAssembled

sequence基因組DNA序列測定示意圖通過隨機(jī)剪切得到的大分子DNA片段克隆到載體上。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進(jìn)行測序，通過“拼裝”得到基因組序列。另一種方法不是根據(jù)片段的染色體位置，而是根據(jù)其重疊部分進(jìn)行“拼裝”。Sequenceallfragmentsandassemble第9章DNA序列分析四、大規(guī)模DNA測序的趨勢－自動化DNA測序?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；闹匾獥l件是自動化和機(jī)械化。目前，DNA制備、克隆文庫組建及篩選、DNA測序分析、數(shù)據(jù)的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆群順序排定等過程均已平行發(fā)展，自動化操作緊隨其后。隨著DNA測序不斷由半自動化向自動化過渡，原始數(shù)據(jù)積累將不成問題，關(guān)鍵是把全基因的散測序組裝起來，以實(shí)現(xiàn)DNA測序的完整性。目前，在亞克隆篩選、模板制備、測序反應(yīng)、堿基閱讀等方面均在一定程度上實(shí)現(xiàn)了自動化。第9章DNA序列分析1、克隆篩選從亞克隆文庫中尋找并篩選單一克隆已逐步實(shí)現(xiàn)了自動化。2、模板制備現(xiàn)有的機(jī)器人被用來自動分離DNA并制備適于傳統(tǒng)操作程度的測序模板。特定用途的DNA分離儀也已采用。3、測序反應(yīng)由于手工測序不能保證所需的再生產(chǎn)能力、高通量和準(zhǔn)確的重復(fù)性，所以，DNA測序反應(yīng)的自動化對大規(guī)模測序是至關(guān)重要的。4、自動放射性自顯影閱讀機(jī)近幾年來，自動化放射性自顯影閱讀機(jī)紛紛上市，并不斷向商業(yè)化及科研應(yīng)用方向發(fā)展。5、自動測序儀DNA自動測序儀的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了凝膠電泳、初始數(shù)據(jù)獲取、堿基閱讀等步驟自動化。第9章DNA序列分析310型全自動遺傳分析儀DNA全自動分析儀：ABIPrism?3100遺傳分析儀

3700型全自動遺傳分析儀安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE500/1000/4000

第9章DNA序列分析分析儀器的新發(fā)展：377型遺傳分析儀3730型遺傳分析儀

377型DNA全自動測序儀采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)合美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司專利的四色熒光標(biāo)記，激光檢測，一個(gè)泳道檢測的方法，一個(gè)測序反應(yīng)保證500bp的準(zhǔn)確序列。

3730型DNA全自動測序儀采用毛細(xì)管電泳，速度更快，效果更好，通量更大，一個(gè)測序反應(yīng)保證800bp的準(zhǔn)確序列，是當(dāng)前基因測序的主打。第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析優(yōu)點(diǎn)：i.四個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)可合并點(diǎn)樣，大大節(jié)省制膠和點(diǎn)樣時(shí)間；

ii.可同時(shí)讀出多個(gè)樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影；