形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要內(nèi)容普通光學(xué)顯微鏡構(gòu)造及原理普通光學(xué)顯微鏡使用不同類型細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及比較實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和普通光學(xué)顯微鏡的使用一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆掌胀ü鈱W(xué)顯微鏡的的基本原理和操作規(guī)程。二.實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成生物機(jī)體的細(xì)胞是多種多樣的。要對細(xì)胞進(jìn)行研究，首先要從其形態(tài)結(jié)構(gòu)入手。所以，要借助顯微鏡的成像及放大原理，在顯微鏡下，才能觀察到細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。

放大約20倍放大約20倍放大約20倍放大約20倍放大約20倍放大約20倍RobertHooke首次觀察并描述了植物細(xì)胞CellRobertHooke首次觀察并描述了植物細(xì)胞A.V.Leeuwenhoek列文虎克1665年世界上第一個(gè)微生物世界的發(fā)現(xiàn)者（發(fā)現(xiàn)了紅血球和酵母菌），1680被吸收為英國皇家學(xué)會(huì)的會(huì)員lentil基礎(chǔ)知識顯微鏡概述：

顯微鏡是觀察細(xì)胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。1.光學(xué)顯微鏡普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(載物臺)、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)等。

尼康E-600顯微鏡

顯微鏡的分辨率:也稱為分辨力，它是指能把兩個(gè)物點(diǎn)辨清的最小距離，分辨距離越大，則分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距離（D）來表示的。其計(jì)算公式為:分辨距離D

=0.61入/N·AN·A·=n·sin(a/2)，

a為透徑視錐頂角，入為光波波長，N·A·為物鏡的數(shù)值孔徑(鏡口率)。

a1a2a1〉a2

在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數(shù)：目鏡(K1)和物鏡(K2)放大倍數(shù)的乘積，公式為:M=K1xK2

顯微鏡的焦點(diǎn)深度：

顯微鏡調(diào)焦到看清楚標(biāo)本某一點(diǎn)時(shí)，不僅是這一點(diǎn)，而且它的上下兩側(cè)也能看清楚，能看清楚的這兩側(cè)的厚度叫做焦點(diǎn)深度。要看到標(biāo)本的全厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細(xì)地從上到下進(jìn)行觀察。T=Kn/M×N.A.其中：K為常數(shù)，約為0.24；

n為被檢標(biāo)本周圍介質(zhì)的折射率；

M為顯微鏡的總放大倍數(shù)；

N.A.為物鏡的鏡口率

2.熒光顯微鏡

尼康E800熒光DIC顯微鏡

熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）

基本原理

當(dāng)用一定波長的光照射某些物質(zhì)時(shí)，一定量的光能被物質(zhì)的分子或原子所吸收，物質(zhì)吸收光能后，激發(fā)出一種高能量電子（躍遷電子），進(jìn)入激發(fā)態(tài)。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，以電磁輻射的形式放出所吸收的光能，所放出的光波長比激發(fā)光長。熒光：光僅在激發(fā)的瞬間或在激發(fā)后的一個(gè)很短時(shí)間內(nèi)放出磷光：激發(fā)光切斷后仍繼續(xù)發(fā)光，且所發(fā)的光比熒光的波長更長自發(fā)性熒光和繼發(fā)性熒光自發(fā)性熒光：細(xì)胞內(nèi)部的許多成分經(jīng)短光波照射后，可以發(fā)出熒光，自發(fā)熒光一般很微弱繼發(fā)性熒光：細(xì)胞內(nèi)有些成分可以與熒光色素結(jié)合而呈現(xiàn)一定顏色的熒光3.激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管

基本原理在激光掃描共聚焦顯微鏡中，掃描激光束經(jīng)光源針孔形成點(diǎn)光源，通過分光鏡和物鏡后聚焦于樣品上。點(diǎn)光源對樣品的焦平面進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，并把結(jié)果匯聚在檢測針孔處成像，再由檢測針孔后的光電倍增管（或冷電感藕合器件）逐點(diǎn)或逐線收集，最后在計(jì)算機(jī)屏幕上形成熒光圖像。共聚焦：照明針孔和檢測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，只有樣品焦平面的光才能經(jīng)檢測針孔到達(dá)檢測器，而焦平面上、下的光則完全被阻擋在檢測針孔的兩邊，從而產(chǎn)生一個(gè)光學(xué)切面。4.暗視野顯微鏡

通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改變途徑，不直接進(jìn)入物鏡，而是傾斜地照射到樣品上，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，由樣品表面的繞射光線入射到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。因此可以在黑暗的背景中觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與形態(tài)，能見到小至0.02-0.004um的微粒子的存在和運(yùn)動(dòng)，但不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

5.相差顯微鏡利用環(huán)狀光欄替代可變光欄，用帶相板的物鏡（通常用ph標(biāo)記）代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡。這些特殊裝置能使未經(jīng)染色的標(biāo)本中各部分的折射率或厚度的微小差異產(chǎn)生相位差，然后利用光的衍射和干涉原理，把相差變成振幅（明、暗）差，使人的眼睛可以辨認(rèn)。觀測活細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。6.偏光顯微鏡

偏光顯微鏡（polarizingmicroscope）用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。7.微分干涉差顯微鏡

DIC顯微鏡其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。

DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）

8.倒置顯微鏡

9.透射電子顯微鏡

JEM-1011透射電子顯微鏡

萊卡超薄切片機(jī)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）

冰凍蝕刻電鏡照片

10.掃描電子顯微鏡

JEOL掃描電子顯微鏡人類血細(xì)胞SEM照片

11.顯微操作技術(shù)

尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

轉(zhuǎn)基因顯微操作過程

1目鏡2目鏡筒3視度調(diào)節(jié)圈4雙目鏡筒5物鏡轉(zhuǎn)換器6物鏡7夾片架8載物臺9聚光鏡10孔徑光欄11聚光鏡調(diào)節(jié)輪12集光鏡13鏡筒固定螺釘14鏡臂15集光鏡固定螺釘16載物臺Y向調(diào)節(jié)輪17微調(diào)輪18粗調(diào)輪19載物臺X向調(diào)節(jié)輪20電源開關(guān)21亮度開關(guān)三、實(shí)驗(yàn)程序

(一)顯微鏡的使用1.觀察前的準(zhǔn)備工作

(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習(xí)慣，觀察時(shí)要雙眼同時(shí)睜開，一邊觀察一邊進(jìn)行記錄或描繪。

(2)觀察時(shí)所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準(zhǔn)備好。

(3)顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個(gè)部件是否完整和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進(jìn)行必要的清潔工作。然后進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)。瞳距調(diào)節(jié)2.顯微鏡的調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)旋鈕聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標(biāo)本④聚光鏡升降旋鈕孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物孔徑光欄開度與圖象100%70%30%孔徑光欄的運(yùn)用操作步驟如下:(1）可變光欄的中心對準(zhǔn)聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，則裝配時(shí)已保證它與聚光鏡合軸，不必調(diào)整;如果可變光欄的水平位置可以移動(dòng)，則應(yīng)把可變光欄關(guān)到最小，使它的中心孔對準(zhǔn)聚光鏡下方的透鏡中心。

(2)載物臺上放置觀察標(biāo)本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度，并將它的可變光欄開到最大，用低倍物鏡，進(jìn)行調(diào)焦到能看見標(biāo)本，可調(diào)反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關(guān)小，最亮的照明區(qū)正處在視野的中央。

(3)轉(zhuǎn)到高倍鏡，并調(diào)焦到看清標(biāo)本，然后去掉標(biāo)本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關(guān)小，看其亮點(diǎn)是否在視野中心，如果不是，就要轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器的調(diào)節(jié)螺旋，把亮點(diǎn)調(diào)到視野中央，再慢慢開啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。3.觀察操作：低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調(diào)焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標(biāo)本移到視野中心，用細(xì)調(diào)焦螺旋把物鏡調(diào)至最清晰處，若要用高倍鏡觀察時(shí)，把所要進(jìn)一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時(shí)針轉(zhuǎn)換成高倍物鏡，然后用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)焦，至看清物像。

4.顯微鏡使用注意事項(xiàng)取鏡：右手握住鏡臂，左手托住鏡座。安放：顯微鏡底座前沿距離實(shí)驗(yàn)臺邊緣約10cm。取罩：輕輕取下顯微鏡罩，折疊好收入抽屜中。開關(guān)電源前，請把光亮度調(diào)到最小處，開電源從外部開至內(nèi)部，關(guān)電源則相反。對光：轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡對準(zhǔn)通光孔。物鏡的前端與載物臺保持2厘米的距離。上片：把所要觀察的載玻片放到載物臺上，用壓片夾壓住，標(biāo)本要正對通光孔。調(diào)焦：長距離調(diào)節(jié)用粗調(diào)，低倍鏡工作距離約為0.5cm，眼睛要看著物鏡和載物臺之間距離，避免物鏡碰到載物臺。切換鏡頭：不同放大倍數(shù)物鏡相互轉(zhuǎn)換時(shí)須使用物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器),而不能撥物鏡長時(shí)間不用時(shí)關(guān)掉電源開關(guān)。換取放置標(biāo)本時(shí)需把載物臺調(diào)到最低位置。使用完畢后做必要的清理，請老師檢查后蓋好防塵罩登記使用者和使用時(shí)間，使用前、后儀器狀況思考題顯微鏡的使用程序？正常及病理細(xì)胞觀察比較正常肝臟：可見門靜脈、肝細(xì)胞索和匯管區(qū)。（1）正常肝細(xì)胞H·E染色玻片標(biāo)本(2)人肝細(xì)胞蘇木精-伊紅(H·E·)染色玻片標(biāo)本的觀察先在干燥系物鏡下觀察肝小葉的概況，辨認(rèn)肝細(xì)胞，然后用油鏡仔細(xì)觀察肝細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。注意肝細(xì)胞的形狀，細(xì)胞核和核仁的形狀和數(shù)量，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的染色區(qū)別等。(3)肝癌細(xì)胞玻片標(biāo)本觀察(4)肝細(xì)胞