理論課21第二十一章 免疫學(xué)檢測(cè)原理

第二十一章免疫學(xué)檢測(cè)原理第一節(jié)免疫細(xì)胞的檢測(cè)

一、免疫細(xì)胞的分離和純化二、淋巴細(xì)胞及亞群的檢測(cè)三、免疫細(xì)胞的功能測(cè)定第二節(jié)免疫分子的檢測(cè)

一、免疫球蛋白的測(cè)定二、補(bǔ)體測(cè)定三、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)四、黏附分子的檢測(cè)第三節(jié)免疫學(xué)檢測(cè)常用的標(biāo)記技術(shù)一、免疫熒光技術(shù)二、放射免疫測(cè)定三、免疫酶標(biāo)技術(shù)1免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)：包括細(xì)胞、分子、相關(guān)基因三個(gè)水平細(xì)胞水平檢測(cè)：根據(jù)免疫細(xì)胞膜表面表達(dá)的獨(dú)特標(biāo)志及特殊功能，測(cè)定各類細(xì)胞及其亞群數(shù)量及效應(yīng)，籍以了解細(xì)胞免疫水平分子水平檢測(cè)：測(cè)定各類Ig、補(bǔ)體、CK及受體、黏附分子水平及生物學(xué)活性，籍以了解各類免疫因子間的相互關(guān)系基因水平檢測(cè)：測(cè)定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控，免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析2

第一節(jié)免疫細(xì)胞的檢測(cè)

一、免疫細(xì)胞的分離和純化依據(jù)細(xì)胞獨(dú)特的表面標(biāo)志、理化性質(zhì)及黏附吞噬能力等差異設(shè)計(jì)不同方法，按不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、擬分離細(xì)胞的種類、純度和數(shù)量等，選擇方法（一）白細(xì)胞的分離根據(jù)紅、白細(xì)胞比重、沉降速度不同分離1、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，紅細(xì)胞沉降速度快，自然分離2、高分子聚合物加速沉降法：明膠、右旋糖酐、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮可使紅細(xì)胞成錢串狀凝集，加速沉降3（二）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離

PBMC包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，人PBMC來(lái)源于外周血，動(dòng)物大、小鼠單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源于脾臟、淋巴結(jié)（MNC）。

標(biāo)本：人肝素防凝外周血；鼠脾臟、淋巴結(jié),機(jī)械研磨過(guò)100目網(wǎng)單個(gè)細(xì)胞懸液。密度梯度離心法：紅細(xì)胞和多核細(xì)胞密度為1.092，PBMC為1.075-1.090，血小板為1.030-1.035；聚蔗糖-泛影葡胺（F-H）分層液法：原理：F-H分層液密度為1.077，將PBMC層加于分層液上離心不同層次液體和細(xì)胞區(qū)帶4（三）淋巴細(xì)胞的純化與亞群分離1、去除紅細(xì)胞：低滲溶解；0.89%氯化銨處理法2、去除單核、粒細(xì)胞：PBMC玻璃、塑料平皿黏附去除3、尼龍毛柱分離法：B細(xì)胞易黏附尼龍毛，過(guò)尼龍毛柱可分離

T、B細(xì)胞4、流式細(xì)胞術(shù)分選法：基本原理：流式細(xì)胞儀可快速、靈敏和高度自動(dòng)化地對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量測(cè)定分析，從而分選特異性熒光抗體標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞（四）單核/巨噬細(xì)胞的分離和收集1、平皿黏附分離法2、斑蝥敷貼法：原理：用斑蝥酒精浸出液貼敷前臂內(nèi)側(cè)皮膚，誘發(fā)無(wú)菌皮炎，收集皮泡滲出液中來(lái)自皮下組織的3、硫基乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基小鼠腹腔收集腹腔滲出5二、淋巴細(xì)胞及亞群的檢測(cè)根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定淋巴細(xì)胞亞群及檢測(cè)計(jì)數(shù)1、T細(xì)胞檢測(cè)1）間接免疫熒光法：原理：抗CD抗體與PBMC結(jié)合加入熒光素標(biāo)記的羊/兔抗小鼠IgG抗體(熒光標(biāo)記二抗)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)2）免疫組織化學(xué)法：原理：酶標(biāo)記抗體與組織切片或細(xì)胞涂片反應(yīng),結(jié)合加入底物酶催化底物顯色普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)表面標(biāo)志鑒定細(xì)胞種類、亞群2、B細(xì)胞檢測(cè)1）膜表面免疫球蛋白（SmIg）檢測(cè)：應(yīng)用抗Ig抗體借助直接免疫熒光法或免疫組織化學(xué)法檢測(cè)2）間接免疫熒光法,同T細(xì)胞6三、免疫細(xì)胞的功能測(cè)定（一）吞噬細(xì)胞功能測(cè)定：1、中性粒細(xì)胞趨化功能測(cè)定濾膜滲透法（Boyden小室法）：上室加待測(cè)細(xì)胞，下室加趨化成分，中間用微孔濾膜隔開(kāi)反應(yīng)濾膜清洗、固定、染色透明普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞穿膜移動(dòng)距離判斷趨化功能2、中性粒細(xì)胞吞噬殺菌功能測(cè)定

NBT（硝基藍(lán)四氮唑還原）試驗(yàn)：原理：中性粒細(xì)胞吞噬殺菌代謝釋放氫攝入的NBT接受胞漿沉積黑色顆粒10%NBT+73、巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定：原理：用斑蝥酒精浸出液貼敷法收集人，用腹腔滲出法收集鼠，體外進(jìn)行雞紅細(xì)胞(有胞核)吞噬實(shí)驗(yàn)，計(jì)算吞噬百分率、吞噬指數(shù)4、巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測(cè)定：測(cè)定對(duì)放射性核素51Cr、

125IUdR

標(biāo)記靶細(xì)胞P815的殺傷活性51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞：51Cr滲透入細(xì)胞漿，細(xì)胞破壞釋放51Cr

于上清中

125IUdR標(biāo)記靶細(xì)胞：125IUdR摻入細(xì)胞DNA，細(xì)胞破壞酶切DNA釋放125I于細(xì)胞沉淀中將效/靶按一定比例混合效/靶相互作用靶細(xì)胞破壞釋放核素測(cè)定上清/細(xì)胞沉淀放射性強(qiáng)度（cpm）按公式計(jì)算殺傷百分率8（二）T細(xì)胞功能測(cè)定1、T細(xì)胞增生（轉(zhuǎn)化）實(shí)驗(yàn)：原理：T細(xì)胞受到絲裂原刺激增生反應(yīng)形態(tài)變化淋巴母細(xì)胞：體積大，染色質(zhì)疏松，核仁明顯等絲裂原：PHA、ConA（鼠）、PWM等1）放射性核素（3HTdR、125IUdR）摻入法：原理:細(xì)胞增生攝取3HTdR/125IUdR測(cè)放射性強(qiáng)度計(jì)算轉(zhuǎn)化率、刺激指數(shù)2）細(xì)胞能量代謝測(cè)定（MTT四氮唑鹽比色法）：原理：活細(xì)胞攝入MTT腺粒體作用胞內(nèi)、胞周藍(lán)黑色甲臜溶解甲臜酶標(biāo)儀檢測(cè)A值，計(jì)算轉(zhuǎn)化率、刺激指數(shù)。甲臜生成量與細(xì)胞代謝活躍程度呈正比，間接定量分析細(xì)胞增生水平92、T細(xì)胞細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)原理

①CTL來(lái)源：免疫動(dòng)物的脾臟或腹腔滲出液；將脾細(xì)胞與刺激細(xì)胞共育，體外誘生CTL②刺激細(xì)胞：預(yù)處理后無(wú)增殖能力，仍保持免疫源性的細(xì)胞③檢測(cè)CTL細(xì)胞毒活性：形態(tài)學(xué)法；51Cr、125IUdR釋放法；流式細(xì)胞術(shù)等。靶細(xì)胞為免疫用細(xì)胞/不處理的刺激細(xì)胞

51Cr、125IUdR釋放法:效/靶按一定比例混合效/靶相互作用靶細(xì)胞破壞釋放核素測(cè)定上清/細(xì)胞沉淀放射性強(qiáng)度（cpm）按公式計(jì)算殺傷百分率103、T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測(cè)法接觸性超敏反應(yīng)：用于研究免疫調(diào)節(jié)藥物對(duì)細(xì)胞免疫的影響某些半抗原涂小鼠皮膚致敏再次接觸半抗原活化的

CD4+TCK接觸性皮炎11（三）B細(xì)胞功能測(cè)定1、B細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)：方法原理與T細(xì)胞同，但絲裂原為PWM，

LPS（鼠），SPA金葡菌，抗IgM抗體等2、溶血空斑形成實(shí)驗(yàn)：原理：SRBC免疫小鼠取脾制成單個(gè)細(xì)胞與SRBC在瓊脂糖凝膠中混合注入平皿或玻片脾細(xì)胞中抗體生成細(xì)胞釋放抗SRBC抗體（溶血素）與周圍

SRBC結(jié)合加入補(bǔ)體抗體生成細(xì)胞周圍溶血肉眼可見(jiàn)的溶血空斑，每空斑代表1個(gè)抗體生成細(xì)胞空斑計(jì)數(shù)3、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）：原理：已知抗原包被于固相載體加入待測(cè)抗體生成細(xì)胞釋放特異性抗體結(jié)合抗原抗體生成細(xì)胞結(jié)合于固相載體加入酶聯(lián)二抗與結(jié)合于固相載體的細(xì)胞上抗體結(jié)合加底物顯色反應(yīng)著色的斑點(diǎn)形成細(xì)胞鏡檢計(jì)數(shù)斑點(diǎn)（計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算、統(tǒng)計(jì)）12（四）NK細(xì)胞活性測(cè)定：靶細(xì)胞：人K562；鼠YAC-11、放射性核素釋放法：51Cr、125IUdR標(biāo)記靶細(xì)胞效/靶相互作用靶細(xì)胞破壞釋放核素測(cè)定上清/細(xì)胞沉淀放射性強(qiáng)度（cpm）公式計(jì)算NK殺傷百分率2、酶釋放法：原理：效/靶相互作用靶細(xì)胞破壞釋放乳酸脫氫酶（LDH）

加底物顯色取上清比色測(cè)LDHA值（光密度值）

公式計(jì)算NK殺傷百分率3、流式細(xì)胞術(shù)：原理：碘化丙叮（PI）與死亡靶細(xì)胞DNA/RNA

結(jié)合

激發(fā)熒光

流式細(xì)胞儀檢測(cè)靶細(xì)胞死亡率13

第二節(jié)免疫分子的檢測(cè)一、免疫球蛋白的測(cè)定常用方法：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法免疫化學(xué)自動(dòng)分析儀測(cè)定二、補(bǔ)體測(cè)定血清總補(bǔ)體活性測(cè)定CH50

原理：應(yīng)用兔抗SRBC抗體-SRBC免疫復(fù)合物激活待測(cè)血清中補(bǔ)體經(jīng)典途徑SRBC溶血以50%溶血為判定結(jié)果的終點(diǎn)，稱CH50。診斷總補(bǔ)含量減少或補(bǔ)體成分缺失

14—（三）補(bǔ)體各種成分測(cè)定C1q、C3、B、C1INH

單向免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法

ELISA（酶免疫吸附檢測(cè)）、RIA（放射免疫測(cè)定）（四）補(bǔ)體裂解產(chǎn)物測(cè)定C3a、C3d、C5a

免疫電泳、交叉免疫電泳、ELISA、RIA

用于某些疾病診斷和病情監(jiān)測(cè)（五）補(bǔ)體受體（CR）測(cè)定酶\熒光素\膠體金標(biāo)記抗CR抗體等診斷補(bǔ)體受體缺陷15三、細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)（一）CK生物學(xué)活性檢測(cè)法原理：根據(jù)CK特定的生物學(xué)活性，采用相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)（各種依賴性細(xì)胞株/靶細(xì)胞），通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，判定樣品中CK活性，用活性單位（U/ml）表示1、細(xì)胞增生或增生抑制法：原理：用對(duì)特定CK依賴/抑制的細(xì)胞株與待測(cè)CK培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞增生或增生抑制，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)判斷活性單位。如IL-2，TGF-。用3HTdR摻入法，MTT法3、細(xì)胞毒活性測(cè)定：原理：以結(jié)晶紫染色法、MTT法等測(cè)TNF

對(duì)特定靶細(xì)胞（L929、WEHI164.13）的細(xì)胞毒活性4、細(xì)胞病變抑制法：原理：以VSV-WISH（人）、VSV-L929（鼠）系統(tǒng)，檢測(cè)IFN對(duì)VSV易感細(xì)胞株的50%病變抑制效應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，判定活性單位16（二）CK免疫學(xué)檢測(cè)

ELISA、免疫PCR、RIA、免疫印跡法（三）CKR檢測(cè)

RIA、標(biāo)記的抗CKR單抗法；

ELISA檢測(cè)sCKR四、黏附分子的檢測(cè)（一）細(xì)胞表面AM檢測(cè)間接免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)、

ELISA、RIA法等（二）可溶性AM檢測(cè)

ELISA法17

第三節(jié)免疫學(xué)檢測(cè)常用的標(biāo)記技術(shù)一、免疫熒光技術(shù)基本原理：以熒光素標(biāo)記的特異性抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑用于相應(yīng)抗原或抗體的分析鑒定和定量測(cè)定（一）免疫熒光顯微技術(shù)熒光顯微鏡觀察1、直接免疫熒光法：特異性抗體直接檢抗原檢出熒光+細(xì)胞2、間接免疫熒光法：二抗標(biāo)熒光檢出熒光陽(yáng)性細(xì)胞（二）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

流式細(xì)胞儀1、分析單個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志2、分選收集不同類型細(xì)胞3、對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞體積等信息分析18二、放射免疫測(cè)定（RIA）

放射性檢測(cè)儀器以放射性核素為示蹤劑的免疫標(biāo)記技術(shù)，將核素分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合（一）RIA

原理：以放射性核素標(biāo)記的抗原（Ag?）和待測(cè)的未標(biāo)記抗原與固定量的特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，或進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)當(dāng)Ag?和Ab量固定時(shí)，Ag?-Ab形成量受Ag含量制約；若Ag量高時(shí)Ag-Ab,Ag?-Ab,Ag?-Ab形成量與未標(biāo)記Ag呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即放射性(cpm)待測(cè)Ag含量，cpm

待測(cè)Ag含量（二）免疫放射測(cè)定（IRMA）

原理：將待測(cè)Ag與過(guò)量Ab?反應(yīng)

Ag-Ab?

加入固相AgAg-Ab?和固相Ag-Ab

離心沉淀去除固相Ag-Ab

檢測(cè)上清Ag-Ab?cpm

推算待測(cè)Ag含量19三、免疫酶標(biāo)技術(shù)基本原理：以酶標(biāo)抗體/抗原與細(xì)胞/組織中抗原/抗體結(jié)合，通過(guò)相應(yīng)酶底物的顯色反應(yīng)，對(duì)待檢細(xì)胞/組織中抗原-抗體定位、定性分析，亦可據(jù)顯色深淺定量分析（一）酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（EIH）

通過(guò)底物被酶顯色示蹤組織中抗原-抗體結(jié)合物的存在

普通光鏡、電鏡觀察

ABC法：用生物素(B)標(biāo)記過(guò)氧化物酶，可攜帶多個(gè)酶分子，可提高酶反應(yīng)敏感性。將親和素(A)與生物素(B)標(biāo)記的過(guò)氧化物酶結(jié)合，形成可溶性親和素-生物素化過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)

檢測(cè)時(shí)，將生物素(B)標(biāo)記抗體/二抗結(jié)合于標(biāo)本加入ABCABC上的親和素(A)結(jié)合于抗體的生物素(B)ABC結(jié)合于標(biāo)本