固定化酶及固定化技術(shù)

關(guān)于固定化酶及固定化技術(shù)酶：在水溶液中－不穩(wěn)定一次性使用-難回收，難連續(xù)化生產(chǎn)用于醫(yī)藥/化學(xué)分析－純度要求高產(chǎn)物的分離純化困難。。。。－－－要求將酶變成不溶性－－－實(shí)際上將酶限制在一定空間固定化第2頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定酶具有催化活性1916年，美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，酶和載體結(jié)合以后，在水中呈不溶解狀態(tài)時(shí)，仍然具有生物催化活性。

固定化酶可重復(fù)使用——操作穩(wěn)定性

酶在固定化后其活力可以緩慢釋放,酶的穩(wěn)定性比天然狀態(tài)高,可重復(fù)多次使用.第3頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)果如圖所示:固定化酶的活力基本保持穩(wěn)定活力損失15%,由此可見(jiàn)該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性例:將0.5gDEAE纖維素固定化殼聚糖酶與10mL1%殼聚糖溶液在60℃下連續(xù)反應(yīng)10次每次反應(yīng)時(shí)間為6h每次反應(yīng)后分別測(cè)定酶活力第4頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、固定化酶（immobilizedenzyme）水溶性酶水不溶性載體固定化技術(shù)水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？第5頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶：是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，限制在一定的空間范圍內(nèi)，可以反復(fù)使用而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。酶的固定化技術(shù)包括吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合（化學(xué)偶聯(lián)）及包埋等多種方法。

第6頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天與固定化酶技術(shù)相配套的是酶生物反應(yīng)器同一般的化工容器一樣，需要對(duì)酶反應(yīng)器溫度和pH等條件進(jìn)行嚴(yán)格的控制；不同的是，酶反應(yīng)器必須進(jìn)行無(wú)菌操作。酶生物反應(yīng)器第7頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天簡(jiǎn)史1916年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith第一次實(shí)現(xiàn)了酶的固定化1960年，千細(xì)一郎，開(kāi)始了氨基?；腹潭ɑ芯?969年，千細(xì)一郎成功的將固定化氨基?；笐?yīng)用于DL-AA的光學(xué)分析上1971年，固定化酶名稱提出，Immobilizedenzyme第8頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天1973年，固定化微生物的應(yīng)用——固定化大腸桿菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸1976年，固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精1978年，日本用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶——固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶1979年，固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)始研究1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)生產(chǎn)氨基酸1986年，郭勇等人固定化原生質(zhì)研究第9頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天第10頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)：穩(wěn)定性高；酶可反復(fù)使用；產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；固定化酶的反應(yīng)條件易于控制生產(chǎn)可連續(xù)化和自動(dòng)化，節(jié)約勞動(dòng)力；設(shè)備小型化、可節(jié)約能源。

固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：第11頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天缺點(diǎn)：固定化所需載體和試劑較貴，成本高，投資大固定化時(shí)，酶活力有損失長(zhǎng)期生產(chǎn)，易污染，載體易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)第12頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、固定化酶制備必須注意維持酶的催化活性及專一性。酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化）避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的條件。由于酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是憑借氫鍵、疏水鍵和離子鍵等弱鍵維持，所以固定化時(shí)要采取盡量溫和的條件，盡可能保護(hù)好酶蛋白的活性基團(tuán)?；驹瓌t：第13頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。載體能抗一定的機(jī)械力。固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。酶與載體必須結(jié)合牢固，利于固定化酶的回收及反復(fù)使用。固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。第14頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶的固定化方法四大類方法：吸附法（包括電吸附法）結(jié)合法（無(wú)機(jī)多孔材料）交聯(lián)法（雙功能試劑）包埋法（微膠囊法）第15頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天——指通過(guò)氫鍵、疏水作用、電子親和力等物理作用，將酶吸附到固體吸附劑表面的方法。

優(yōu)點(diǎn)：操作條件溫和，固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象較少或者不變化；載體廉價(jià)易得缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附選擇載體的原則（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面（3）便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。1.物理吸附法SMS:一種硅酸鹽載體有機(jī)載體：纖維素、骨膠原、火棉膠無(wú)機(jī)載體：氧化鉛、皂土、白土、

高嶺土、多孔玻璃、

硅藻土、二氧化鈦等第16頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.結(jié)合法離子鍵結(jié)合法是指通過(guò)離子鍵將酶結(jié)合到具有離子交換基團(tuán)的非水溶性載體上的方法。陰離子交換劑：DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠，AmberliteIRA-93，410，900；

陽(yáng)離子交換劑：CM-纖維素，AmberliteCG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。第17頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度離子結(jié)合法的操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。但是載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶往往會(huì)從載體上脫落。第18頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天這是酶與載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法，是載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法。歸納起來(lái)有二類：將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。在載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。(與交聯(lián)法合用）共價(jià)結(jié)合法第19頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。第20頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體第21頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)

然后活化該活潑基團(tuán)最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵關(guān)鍵共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”載體活化—活化基團(tuán)＋酶分子基團(tuán)第22頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶分子和載體連接的功能基團(tuán)：酶蛋白N-端的α-氨基或賴氨酸殘基的氨基酶蛋白C-端的羧基以及Asp殘基的?-和γ-羧基Cys殘基的巰基Ser、Tyr、Thr殘基的羥基Phe、Tyr殘基的苯環(huán)His殘基的咪唑基Trp殘基的吲哚基第23頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天第24頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．硅烷化法E．溴化氰法載體活化的方法第26頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天共價(jià)結(jié)合法與離子結(jié)合法或物理吸附法相比：優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。缺點(diǎn)：該方法反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜；由于采用了比較激烈的反應(yīng)條件，會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般為30％左右，甚至底物的專一性等酶的性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化。只能用于酶，不能用于微生物的固定化第27頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.交聯(lián)法——是指通過(guò)雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑是戊二醛、己二胺、雙偶氮苯等水溶性化合物。第28頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天戊二醛的兩個(gè)醛基都可以與酶或者蛋白質(zhì)的游離氨基酸反應(yīng)，形成Schiff堿，從而使酶或者菌體蛋白交聯(lián)，形成固定化酶或固定化菌體。第29頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：采用天然高分子聚合物幾丁質(zhì)作載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)將纖維素酶固定在幾丁質(zhì)上，在戊二醛濃度1.25%，pH值4.0時(shí)固定纖維素酶，該固定化酶的半衰期為60天。用于降解殼聚糖，效果明顯。第30頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天交聯(lián)法反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般較低，但是盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶比活的提高。單獨(dú)使用交聯(lián)法所得到的固定化酶顆粒小、機(jī)械性能差，酶活低，故常與其他方法聯(lián)用第31頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子:

（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶

（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶第32頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.包埋法是指將酶或含酶微生物包裹在多孔的載體中。網(wǎng)格型；微囊型。第33頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天網(wǎng)格法——將酶分子或微生物包埋在凝膠格子里。天然凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹(shù)脂等。網(wǎng)格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。第34頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天微囊型半透膜包埋法（微囊化法）：將酶包埋在有各種高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜等第36頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天微囊型固定化酶通常直徑為幾微米到幾百微米的球狀體，顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。微囊發(fā)生器第37頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天第38頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶的固定化模式第39頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天各類固定化方法的特點(diǎn)比較:比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費(fèi)用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶第40頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天沒(méi)有一個(gè)方法是十全十美的包埋、共價(jià)結(jié)合、共價(jià)交聯(lián)三種雖結(jié)合力強(qiáng)、但不能再生、回收；吸附法制備簡(jiǎn)單，成本低，能回收再生，但結(jié)合差，在受到離子強(qiáng)度、pH變化影響后，酶會(huì)從載體上游離下來(lái)。包埋法各方面較好，但不適于大分子底物和產(chǎn)物。第41頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天其他固定化酶方法結(jié)晶法：分散法：熱處理法等等第42頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天判斷固定化方法的優(yōu)劣及其固定化酶的實(shí)用性的指標(biāo)有:

(1)相對(duì)酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值通常高于75%

(2)酶的活力回收率固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力之百分比稱為酶的活力回收率。一般情況下,活力回收率應(yīng)小于1,若大于1,可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素排除的結(jié)果.

(3)固定化酶的半衰期衡量操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵.

第43頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶的過(guò)程中還存在幾個(gè)亟待解決解決的難題：酶的活性中心發(fā)生物理化學(xué)變化導(dǎo)致酶活力降低酶固定化后多了空間屏障,增加了傳質(zhì)阻力酶和載體結(jié)合不牢固,容易脫落,酶活力損失大固定化顆粒成型困難

第44頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化技術(shù)的改進(jìn)定點(diǎn)固定化技術(shù)

抗體偶聯(lián)、生物素－親和素親和、氨基酸置換（Cys）多酶系統(tǒng)的共固定化多種酶同時(shí)固定在膜材料上,利用各自的功能協(xié)同催化復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新型的固定化技術(shù)高分子技術(shù)、納米技術(shù)、光、輻射等作用

加入表面活性劑

可使酶活性大幅度提高，最高的達(dá)100

倍，并增加了酶使用次數(shù)等等第45頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)的影響不同制備方法，對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響不同假定：酶固定化后，在載體表面或多孔介質(zhì)中的分布完全均質(zhì)整個(gè)系統(tǒng)各相同性四、固定化酶性質(zhì)的變化：第46頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天(一）影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的酶及載體材料的性質(zhì)及相互作用。

第47頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天成分參數(shù)酶生物化學(xué)性質(zhì)：分子量，輔基，蛋白質(zhì)表面的功能基團(tuán)，純度（雜質(zhì)的失活或保護(hù)作用）動(dòng)力學(xué)參數(shù)：專一性，pH及溫度曲線，活性及抑制性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)pH，溫度，溶劑，去污劑及雜質(zhì)的穩(wěn)定性。載體化學(xué)特征：化學(xué)組成，功能基，膨脹行為，基質(zhì)的可及體積，微孔大小及載體的化學(xué)穩(wěn)定性

機(jī)械性質(zhì)：顆粒直徑，單顆粒壓縮行為，流動(dòng)抗性（固定床反應(yīng)器），沉降速率（流體床），對(duì)攪拌罐的磨損。固定化酶固定化方法：所結(jié)合的蛋白,活性酶的產(chǎn)量,內(nèi)在的動(dòng)力學(xué)參數(shù)質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應(yīng):分配效應(yīng)（催化劑顆粒內(nèi)外不同的溶質(zhì)濃度），外部或內(nèi)部（微孔）擴(kuò)散效應(yīng)；這些給出了游離酶在合適反應(yīng)條件下的效率。穩(wěn)定性:操作穩(wěn)定性(表示為工作條件下的活性降低)，貯藏穩(wěn)定性效能:生產(chǎn)力（產(chǎn)品量/單位活性或酶量），酶的消耗（酶單位數(shù)/公斤產(chǎn)品）第48頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天包括：酶本身的變化:

主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化;載體的影響：

在固定化酶的周?chē)?，形成了能?duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層以及靜電的相互作用等引起的變化。載體與酶的相互作用：

載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié)構(gòu)、封閉酶活性部位等。第49頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天改變之一：構(gòu)象改變、立體屏蔽構(gòu)象改變：

酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，導(dǎo)致酶與底物結(jié)合能力或催化能力下降立體屏蔽：

固定化后，使得酶的活性中心或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使得效應(yīng)物或者底物與酶的臨近或者接觸受到干擾第50頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天改變之二：分配效應(yīng)、擴(kuò)散限制微環(huán)境：

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。分配效應(yīng)：

由于載體性質(zhì)，造成底物和效應(yīng)物等在微觀體系和宏觀體系之間的不等性分配，從而影響酶促反應(yīng)速度第51頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天擴(kuò)散限制效應(yīng)：底物、產(chǎn)物和效應(yīng)物等，在環(huán)境中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度收到限制DEAE纖維素固定化殼聚糖酶:以DEAE纖維素為載體戊二醛為交聯(lián)劑固定殼聚糖酶第52頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天改變之三：微擾由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性質(zhì),直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力第53頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.固定化后酶活力的變化固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變。例如：

用羧甲基纖維素載體固定的胰蛋白酶消化不同底物：

酪蛋白（高分子）－－原酶活力的30%

苯酞精氨酸-對(duì)硝基酰替苯胺(低分子)－原酶活力的80%。一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。第54頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天原因：酶結(jié)構(gòu)的變化空間位阻不過(guò)，也有個(gè)別情況，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾，或固定化過(guò)程提高了酶的穩(wěn)定性。第55頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天在同一測(cè)定條件下，固定化酶的活力要低于等摩爾原酶的活力的原因可能是：①酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用；③內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；④包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能過(guò)膜與酶接近。第56頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天Merlose曾選擇50種固定化酶，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)：30種酶穩(wěn)定性提高，12種酶無(wú)變化，8種酶穩(wěn)定性降低。然而，由于目前尚未找到固定化方法與穩(wěn)定性之間規(guī)律性，因此要預(yù)測(cè)怎樣才能提高穩(wěn)定性還有一定困難，但大多數(shù)情況下酶經(jīng)過(guò)固定化后穩(wěn)定性提高了。2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響第57頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因可能有以下幾點(diǎn)：①固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形。②酶活力的緩慢釋放。③抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解第58頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化青霉素?；笇⒚赣?.05mol／L的PBS（pH7.5）中分別在不同溫度下保溫6小時(shí)，冷卻后測(cè)定酶活力。固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于自然酶。固定化酶的穩(wěn)定性變化固定化酶；2.自然酶a.熱穩(wěn)定性提高第59頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)試結(jié)果:5天后其活性仍可保留96%.例:將DEAE纖維素固定化殼聚糖酶浸泡在95%的乙醇中，連續(xù)5天測(cè)其催化活性b.對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高第60頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，使本來(lái)不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。提高酶對(duì)某些抑制劑的穩(wěn)定性可以預(yù)計(jì)，今后固定化酶在有機(jī)合成中應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。第61頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天c.對(duì)pH的穩(wěn)定性提高青霉素?；冈诓煌琾H值的緩沖液中，于37℃保溫16h測(cè)定酶活力。固定化酶在pH5.5-10.3活力穩(wěn)定；游離酶則僅在pH7.0-9.0穩(wěn)定。固定化酶的pH穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。第62頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天d.對(duì)蛋白質(zhì)水解酶的抗性

固定化后載體與酶的緊密連接對(duì)其起一定保護(hù)作用,并在空間上阻礙酶與大分子物質(zhì)接近,從而降低了酶與大分子物質(zhì)結(jié)合的幾率,防止酶被其他蛋白酶水解.第63頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天此外：有些固定化酶經(jīng)過(guò)貯藏，可以提高其活性。

大多數(shù)酶經(jīng)固定化后提高了貯藏的穩(wěn)定性，如固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在4℃下，120天酶活力無(wú)變化。第64頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)操作穩(wěn)定性都有影響第65頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天

如圖：固定化酶的最適溫度為60°C，而游離酶的最適溫度為50°C而固定化酶在50-65°C范圍內(nèi)都保持了較高的酶活力,這說(shuō)明殼聚酶經(jīng)固定化后其在較高溫度下的適應(yīng)范圍有了明顯提高3.固定化酶的最適溫度的變化固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以固定化酶的最適溫度提高當(dāng)然，也有報(bào)道最適溫度不變或下降的。第66頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.最適pH值的變化酶的催化能力對(duì)外部環(huán)境特別是pH非常敏感。酶固定化后，對(duì)底物作用的最適pH和pH-活性曲線常常發(fā)生偏移。第67頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天pH對(duì)固定化酶的影響1）載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動(dòng)。載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。（2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH比游離酶的最適pH值；反之則低第68頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天例:取0.2gDEAE纖維素固定化殼聚糖酶與5mL殼聚糖酶液各8份分別于不同pH下測(cè)定固定化酶和游離酶的活力可見(jiàn)：固定化酶的最適pH向酸性偏移第69頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：取0.15g固定化黃曲霉毒素解毒酶和4ML黃曲霉毒素解毒酶液各8份，分別于不同pH下測(cè)定固定化酶和游離酶的活力可見(jiàn)：固定化酶的最適pH向堿性偏移第70頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響固定化酶Km的因素：

1.酶的空間立體障礙載體為電中性時(shí)，由于擴(kuò)散限制造成表觀Km上升。

2.電荷效應(yīng)（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km3.溶液的離子強(qiáng)度5.固定化酶的米氏常數(shù)（Km）變化第71頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：取DEAE纖維素固定化殼聚糖酶0.2g與1%殼聚糖酶液5mL各6份分別加入2mL不同濃度的殼聚糖溶液(0.4%1.5%)于50°C水浴中保溫60min測(cè)定還原糖濃度，用雙倒數(shù)作圖求得米氏常數(shù)

如圖：經(jīng)線性擬合可求得Km(固)=18.87g/L

Km(游)=2.49g/L第72頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天本實(shí)驗(yàn)中選用的載體DEAE纖維素和底物殼聚糖所帶電荷相反使得Km值降低；酶固定化后產(chǎn)生的空間立體障礙或擴(kuò)散阻力使得Km值升高,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出固定化過(guò)程中載體所帶的電荷的極性對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所提取的殼聚糖酶的米氏常數(shù)的影響較酶經(jīng)固定化后所產(chǎn)生的空間擴(kuò)散阻力對(duì)酶的米氏常數(shù)的影響小，所以最后酶Km提高。第73頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)一般評(píng)價(jià)：1．酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活單位。2.酶比活定義（游離）：每毫克所具有的酶活力單位第74頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）第75頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量(或酶活力)的百分?jǐn)?shù)表示：由于在偶聯(lián)反應(yīng)中酶往往會(huì)有些失活，因此，測(cè)定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力，所以，仍以測(cè)定蛋白量較為難確。第76頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.活力回收酶固定化—般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)稱為活力回收率。5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力第77頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、固定化細(xì)胞利用胞內(nèi)酶制作固定化酶時(shí)，需要破碎細(xì)胞，然后提取酶，這就增加了工序和成本。科學(xué)家設(shè)想直接固定含所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞固定化細(xì)胞與固定化酶比較，其優(yōu)越性在于：保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，而且無(wú)需輔酶再生。

第78頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天20世紀(jì)70年代，科學(xué)家研制成固定化細(xì)胞，并且用于生產(chǎn)。例如，將酵母菌細(xì)胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在瓊脂中，制成的固定化酵母菌細(xì)胞，可以用于酒類的發(fā)酵生產(chǎn)固定化增殖細(xì)胞發(fā)酵更具有顯著優(yōu)越性第79頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化細(xì)胞分類、形態(tài)特征和生理狀態(tài)：分類方式固定化細(xì)胞類型細(xì)胞類型微生物、植物、動(dòng)物生理狀態(tài)死細(xì)胞：完整細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞器活細(xì)胞：增殖細(xì)胞，靜止細(xì)胞，饑餓細(xì)胞第80頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天形態(tài)特征：固定化細(xì)胞由于其用途和制備方法的不同，可以是顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀（與吸附物形狀相同）等，目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體，這是因?yàn)椋翰灰?guī)則形狀的固定化細(xì)胞易磨損，在反應(yīng)器內(nèi)尤其是柱反應(yīng)器內(nèi)易受壓變形，流速不好，圓形珠體由于其表面積最大，與底物接觸面較大，所以生產(chǎn)效率相對(duì)較高。第81頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞被固定在載體內(nèi)在形態(tài)學(xué)上一般沒(méi)有明顯的變化。但是，掃描電鏡觀察到固定化酵母細(xì)胞膜有內(nèi)陷現(xiàn)象。無(wú)論用海藻酸鈣、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠包埋，都有類似情況。形成“凹池”的原因尚待進(jìn)一步研究。第82頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化死細(xì)胞：一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法的處理，如加熱、勻漿、干燥、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加細(xì)胞膜的滲透性或抑制副反應(yīng)，所以比較適于單酶催化的反應(yīng)。第83頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化靜止細(xì)胞和饑餓細(xì)胞在固定化之后細(xì)胞是活的，但是由于采用了控制措施，細(xì)胞并不生長(zhǎng)繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。第84頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化增殖細(xì)胞又稱固定化生長(zhǎng)細(xì)胞，是將活細(xì)胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中保持旺盛的生長(zhǎng)、繁殖能力的一種固定化方法。第85頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天與固定化酶和固定化死細(xì)胞比較固定化增殖細(xì)胞能夠不斷繁殖、更新，反應(yīng)所需的酶也就可以不斷更新，而且反應(yīng)酶處于天然的環(huán)境中，更加穩(wěn)定，因此，固定化增殖細(xì)胞更適宜于連續(xù)使用。從理論上講，只要載體不解體，不污染，就可以長(zhǎng)期使用。固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部酶活性，因此，更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)，所以說(shuō)，固定化增殖細(xì)胞在發(fā)酵工業(yè)中最有發(fā)展前途。第86頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化增殖細(xì)胞發(fā)酵的優(yōu)越性1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生產(chǎn)菌集合體

2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用

3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。(膜的選擇通透性）

4、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)5、抗污染能力強(qiáng)第87頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化細(xì)胞技術(shù)的局限性：(1)必須保持菌體完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。(3)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用,載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性.(4)如利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物；但這些缺點(diǎn)并不影響它的實(shí)用價(jià)值。第88頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶與細(xì)胞的選擇依據(jù)：對(duì)一個(gè)特定的目的和過(guò)程來(lái)說(shuō)，是采用細(xì)胞，還是采用分離后的酶作催化劑。要根據(jù)過(guò)程本身來(lái)決定。一般說(shuō):對(duì)于一步或兩步的轉(zhuǎn)化過(guò)程用固定化酶較合適。對(duì)多步轉(zhuǎn)換，采用整細(xì)胞顯然有利。缺點(diǎn)：固定化后的細(xì)胞不易與反應(yīng)物接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降第89頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化微生物和動(dòng)植物細(xì)胞的應(yīng)用固定化微生物細(xì)胞：用于生產(chǎn)酒類、氨基酸、有機(jī)酸、抗生素以及酶和輔酶，也可以用于有機(jī)溶劑生產(chǎn)，廢水處理等固定化植物細(xì)胞：主要用于生產(chǎn)人工種子、香精、色素、藥物、酶等固定化動(dòng)物細(xì)胞主要用于生產(chǎn)疫苗第90頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、固定化酶的應(yīng)用

1、在工業(yè)上的應(yīng)用用固定化酶可以生產(chǎn)L-氨基酸，葡萄糖及葡糖漿、核苷酸、半合成的抗生素母核等L－氨基酸的生產(chǎn)：用固定化酶（氨基酰化酶）折分DL－氨基酸可連續(xù)生產(chǎn)L－氨基酸。如固定化的細(xì)胞（大腸桿菌）生產(chǎn)L－Asp：以120L柱式反應(yīng)器60天可生產(chǎn)5噸的L－Asp。第91頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天乙酰-DL-AlaL-Ala+乙酸 乙酰-D–Ala

（A-D-Ala）Aminoacylase

氨基?；傅?2頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第93頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶用于水解牛奶中的乳糖

牛奶中含有4．3％-4．5％的乳糖，乳糖酶缺乏癥的人飲用牛奶后將導(dǎo)致不良后果。用乳糖酶可以將乳糖分解為組成乳糖的兩個(gè)單糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反應(yīng)器可以連續(xù)處理牛奶，將乳糖分解乳糖在溫度較低時(shí)易結(jié)晶，用固定化乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋類產(chǎn)品中結(jié)晶．改善口感。第94頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天嚴(yán)重腎臟疾病，需血液透析。過(guò)濾尿素和尿酸等代謝廢物利用固定化脲酶透析液和活性碳構(gòu)成的體外循環(huán)裝置固定化脲酶：脲酶與離子交換樹(shù)脂通過(guò)微囊法制備而成的脲酶水解尿素為氨和CO2，氨被樹(shù)脂吸附，CO2由肺呼出，其他代謝物由活性碳吸附2.在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用人工腎：第95頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天治療癌癥正常細(xì)胞：L-Asn合成酶，Asn被消耗的同時(shí)不斷合成維持細(xì)胞蛋白質(zhì)合成需要癌細(xì)胞：缺少活無(wú)L-Asn合成酶，Asn被消耗，影響蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞“餓死”用固定化的天冬酰胺酶治療白血病第96頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天利用尼龍或尿素聚合物半透膜制備成微囊型L-天冬酰胺酶,用于白血病治療。改變了酶的最適pH；微囊型酶對(duì)蛋白酶穩(wěn)定；注射到大白鼠腹腔內(nèi)，急性毒性很低、也不會(huì)產(chǎn)生抗體；除制成微囊型外，還有人采用酶管或酶板形式進(jìn)行體外循環(huán)治療，也達(dá)到了預(yù)期的療效。第97頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天微囊型固定化酶將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合物內(nèi)，制成所謂的微囊型固定化酶。小分子底物或產(chǎn)物可自由地透過(guò)膠囊的半透膜，而酶作為大分子則不能透過(guò)膠囊；此外，膠囊外的一些蛋白質(zhì)、酶、抗體等高分子物質(zhì)也不能進(jìn)入膠囊內(nèi)部，這就避免了發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)。

第98頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天

膠囊型固定化酶的另一大優(yōu)點(diǎn)是，膠囊內(nèi)的酶仍以溶解狀態(tài)作用于底物。因此突破了狹義的固定化酶的定義，也為固定化酶應(yīng)用于臨床提供了可能性。

與此同時(shí)，人們采用人血清白蛋白替代尼龍、硝酸纖維等作為制造膠囊的材料，使包裝材料更具有安全、穩(wěn)定和體內(nèi)易代謝等特點(diǎn)。第99頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天

是一種與x染色體連鎖的遺傳代謝病

患者由于先天性缺乏HGPRT，導(dǎo)致體內(nèi)次黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤補(bǔ)救途徑的障礙，并進(jìn)而引起腎結(jié)石、痛風(fēng)。

Lesch-Nyhan綜合癥第100頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天

Chang等人利用微囊型嘌呤氧化酶治療Lesch-Nyhan綜合癥，使次黃嘌呤的水平顯著下降，同時(shí)發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤能很快地進(jìn)入微囊體中并被代謝。在以兩歲半大的病孩所做的臨床試驗(yàn)中，他們也發(fā)現(xiàn)效果很好。第101頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天藥物控釋載體：新的藥物（包括化學(xué)合成藥、天然藥物及基因工程藥物）不斷問(wèn)世，但將它們應(yīng)用于臨床卻并不很順利：很多藥物尤其是蛋白質(zhì)類藥物，口服易被胃酸破壞或沉淀；單純注射后瞬時(shí)血藥濃度升高，但馬上被肝臟及血液中的酶系統(tǒng)所清除，需要反復(fù)注射，不僅增加治療費(fèi)用，而且增加了感染的機(jī)會(huì)；腫瘤化療用細(xì)胞毒性物質(zhì)選擇性較差，全身毒副作用嚴(yán)重；有些藥物如反義核酸親水性強(qiáng)難于穿過(guò)細(xì)胞膜；蛋白質(zhì)類藥物容易引起免疫反應(yīng)；很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。第102頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天以上問(wèn)題往往不能用簡(jiǎn)單的藥物改構(gòu)來(lái)完成，因此，為藥劑學(xué)工作者提出了嚴(yán)峻的任務(wù)。近30年來(lái)，藥物的新劑型發(fā)展很快，已逐步建立了基于藥物理化性質(zhì)及作用特點(diǎn)的合理給藥體系，其核心特點(diǎn)是從時(shí)間和空間分布上控制藥物的釋放。

第103頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天在腫瘤的化學(xué)治療及重組蛋白質(zhì)類藥物制劑中比較重要的幾種控釋體系有聚合物修飾、凝膠包埋、微球、脂質(zhì)體及免疫導(dǎo)向等。這幾種控釋體系都涉及到將藥物與聚合物載體偶聯(lián)或固定于某種聚合物載體上，因此也可稱為載體藥物第104頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天聚合物修飾多用于蛋白質(zhì)類藥物。這類藥物生物半衰期短、免疫原性強(qiáng)，可用適當(dāng)?shù)乃苄愿叻肿泳酆衔锛右孕揎椧愿纳破湫阅?。羧甲基殼聚糖?duì)天門(mén)冬酰胺酶的修飾,聚乙二醇對(duì)原核表達(dá)重組人血小板生成素分子的修飾等，均可起到降低毒性、延長(zhǎng)半衰期的作用。此外，小分子藥物也可使用這一系統(tǒng)，如將抗癌藥，羥基硫胺素及氨甲蝶呤偶聯(lián)于羧甲基纖維素后注射，可使荷瘤小鼠平均生存時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)2倍左右。第105頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠包埋即用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制成含有藥物的凝膠，植入體內(nèi)特定部位，以達(dá)到緩釋給藥的效果。藥物從凝膠中釋出后，經(jīng)周?chē)M織吸收，然后進(jìn)入血液循環(huán)或直接局部作用，避開(kāi)了首過(guò)效應(yīng)，生物利用度高，作用時(shí)間長(zhǎng)。第106頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天微球制劑用高聚物微球包埋或化學(xué)偶聯(lián)藥物可制成微球制劑，它具有：靶向性、緩釋性及減少抗藥性等特點(diǎn)。微球與靶細(xì)胞接觸，可以通過(guò)胞飲進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)生作用，不影響細(xì)胞膜通透性，不會(huì)產(chǎn)生抗藥性。第107頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天早期使用的微球制劑為不被生物降解的，多為口服制劑?，F(xiàn)在用于注射的多為可生物降解小于1

m的微球，如以生物可降解微球包埋入生長(zhǎng)激素肌注動(dòng)物，血藥濃度穩(wěn)定、不產(chǎn)生抗體，注射部位組織無(wú)病變。微球還可用于基因治療及基因疫苗的載體。第108頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天脂質(zhì)體

-----磷脂雙分子層在水溶液中，自發(fā)形成的超微型中空小泡。第109頁(yè),共125頁(yè)，2024年2月25日，星期天

現(xiàn)查明是因缺乏氨基己糖酶A，使神經(jīng)節(jié)苷脂累積在組織內(nèi)，從而出現(xiàn)神經(jīng)遲鈍、肌肉無(wú)力、失聰、視網(wǎng)膜有櫻桃紅點(diǎn)等癥狀.

黑蒙性癡呆(Tay-Sach病)第110頁(yè),共125頁(yè)，2024年2