土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

關(guān)于土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)課題背景：1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶第2頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對(duì)照第3頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1、實(shí)例：DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。美國(guó)微生物學(xué)家布魯克于1996年在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)的Taq細(xì)菌中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶第4頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。為什么Taq細(xì)菌能從熱泉中被篩選出來(lái)呢?第5頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。第6頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基第7頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素有，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源,才能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。5、請(qǐng)你分析該培養(yǎng)基的配方,想一想這種培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用?如具有,是如何進(jìn)行選擇的?第8頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第9頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天公式：觀察到的紅細(xì)胞平均數(shù)觀察到的細(xì)菌平均數(shù)紅細(xì)胞含量細(xì)菌含量=第10頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。第11頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天設(shè)置重復(fù)組的重要性：第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說(shuō)服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值。這個(gè)實(shí)例啟示學(xué)生，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第13頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。第14頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。第15頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）設(shè)置對(duì)照。。第16頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。方案三:培養(yǎng)基滅菌后接種不能分解尿素的微生物,觀察有無(wú)菌落生成,如有,說(shuō)明培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污染了或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)。第17頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天二.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。土壤微生物種類最多、數(shù)量最大的原因是什么？土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，環(huán)境條件適宜第18頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行[三]樣品的稀釋第19頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第20頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第21頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度、顏色等方面第22頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物的培養(yǎng)與觀察第23頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天操作提示[一]無(wú)菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時(shí)間第24頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30—300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。第25頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天五.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。第26頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天課題延伸CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶pH升高指示劑（酚紅）將變紅第27頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過(guò)記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。第28頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌呈黑色中心,有或無(wú)金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征

第29頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天本課題知識(shí)小結(jié):第30頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練CD第31頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.下列說(shuō)法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值

C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC第32頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2008年高考廣東卷)苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細(xì)菌菌株。篩選的主要步驟如下圖所示：①為土壤樣品。請(qǐng)回答下列問題：(1)②中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應(yīng)加入作為碳源。②中不同濃度碳源的培養(yǎng)基______(A.影響；B.不影響)細(xì)菌的數(shù)量。如果要測(cè)定②中活細(xì)菌數(shù)量，常采用法。苯酚A稀釋涂布平板第33頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)④為對(duì)照，微生物在④中不生長(zhǎng)、在⑤中生長(zhǎng)。④與⑤培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于；使用________法可以在⑥上獲得單菌落。采用固體平板培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)為什么進(jìn)行倒置培養(yǎng)？(3)如何比較不同菌株降解苯酚能力的大?。竣懿缓椒?，⑤以苯酚為唯一碳源平板劃線避免培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生的水分影響微生物的生用同樣苯酚濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)不同菌株，一定時(shí)間后，測(cè)定培養(yǎng)液中苯酚含量第34頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天請(qǐng)根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第35頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天請(qǐng)根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第36頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天請(qǐng)根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第37頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天請(qǐng)根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖尿素例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第38頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天請(qǐng)根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖尿素固體例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第39頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天請(qǐng)根據(jù)以上配方，回答下列問題：(1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_____類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中最主要的碳源是________，氮源是______。(2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_______培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的作用劃分是________培養(yǎng)基。4葡萄糖尿素固體選擇例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第40頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)該培養(yǎng)基具有選擇作用的原因是

。例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第41頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)該培養(yǎng)基具有選擇作用的原因是

。該培養(yǎng)基中，唯一的氮源是尿素，只有能分解尿素的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和繁殖例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第42頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)該培養(yǎng)基中，可通過(guò)檢測(cè)pH的變化來(lái)判斷尿素是否被分解，依據(jù)的原理是

。例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方第43頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)該培養(yǎng)基