《蛋白質印跡》幻燈片

《蛋白質印跡》幻燈片本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！概論印跡法是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜〔NC膜〕上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法(southernblot)。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進展印跡分析。Northernblot:對RNA的印跡分析Westernblot:對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析Easternblot:對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析概論Westernblot：把電泳別離的蛋白質轉移到固定膜上，并用抗原抗體反響進展特異性檢測的過程。是集電泳、轉印和免疫標記為一體的蛋白質別離檢測技術,結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等特點，可檢測到低至1～5ng〔最低可到10－100pg〕的靶蛋白。Westernblot是檢測蛋白質混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作為確定目的蛋白在不同細胞或同種細胞在不同條件下的相對含量的半定量方法Westernblot測定的不是蛋白的絕對含量，只是目的蛋白的相對含量：目的蛋白的存在與否特定實驗條件下目的蛋白表達量的變化多種因素影響信號的強弱受，一般僅作為半定量指標不同目的蛋白由于所用檢測的抗體不同，其含量不具有可比性WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS電泳轉膜鑒定膜上特定蛋白封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternblottingIsolationIdentification1.蛋白樣品提?。嚎傮w原那么

1〕提取時盡可能只集中于提取目的蛋白。通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品2〕保持蛋白的處于溶解狀態(tài)通過裂解液的PH鹽濃度外表活性劑、復原劑等的選擇3〕提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，低溫操作，參加適宜的蛋白酶和磷酸酶抑制劑4〕盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子通過參加核酸酶或采取不同提取策略5〕樣品分裝，長期于-80℃中保存，防止反復凍融。一、蛋白質的樣品制備通過稀釋使不同樣品具有一樣濃度，必要時需要對蛋白進展?jié)饪s。常用的蛋白濃度測定方法包括：Bradford法，Lowry法，BCA法2.蛋白質濃度測定方法原理靈敏性干擾因素應用Lowry法Folin－酚試劑法蛋白質在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，還原酚磷鉬酸產(chǎn)生藍色化合物，藍色深淺與蛋白質濃度呈線性關系較高（約5μg/ml）

適用于脂類含量較高的樣品測定，也能耐受相當濃度的去垢劑如SDS。受硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇干擾耗費時間長40～60分鐘；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化;標準曲線不是嚴格的直線形式，專一性較差Bradford法考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合呈藍色，在波長595nm吸收峰，在一定的范圍內(nèi)與蛋白質的含量呈線性關系高（約1～5μg/ml）,易受強堿性緩沖液，TritonX-100，SDS等去污劑的影響快速5～15分鐘，顏色穩(wěn)定；深淺隨不同蛋白質變化;標準曲線有輕微的非線性BCA法BCA法基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質將Cu2+還原

成Cu+，BCA螯合Cu1+

作為顯色劑，產(chǎn)生蘭紫色并在562nm有吸收峰很高（0.5-20μg/ml）不易受一般濃度去污劑的干擾可受螯合劑、略高濃度的還原劑的影響較快40分鐘內(nèi)，抗干擾能力強SDS電泳，是在PAGE系統(tǒng)中引進SDS〔十二烷基硫酸鈉〕，SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質的空間構造，而電泳系統(tǒng)中存在的強復原劑〔DTT或β-巰基乙醇〕能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的棒狀構造的SDS-蛋白質復合物，降低或消除了不同蛋白質分子間天然的電荷和分子形狀的差異，蛋白質在電泳時的遷移速度僅取決于其分子大小。二.SDS電泳當SDS單體濃度>1mm時，大多數(shù)蛋白質與SDS的結合比為1.4gSDS/g蛋白質)，形成蛋白質SDS復合物當分子量在15～200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：

logMW=K-bX式中：MW:分子量X:遷移率k、b:常數(shù)電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關SDS－PAGE電泳消除了原攜帶電荷的差別，遷移僅與分子量有關除了電荷作用，同時具有分子篩作用丙烯酰胺(Arc)和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)

SDS配膠的Tris緩沖液TEMEDAP(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份以溫熱(利于溶解)的去離子水配制含有29%(w/v)Arc和1%(w/v)Bis儲存液,儲于棕色瓶，4℃避光保存。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。Mini系列是8.6x6.8cmBio-RedMini電泳裝置SDS－PAGE電泳分離只取決于分子解聚后SDS-蛋白質膠束的大小，因此凝膠濃度的正確選擇尤為重要。不同分子量范圍的蛋白質應選用不同濃度的凝膠濃度。濃度太大，孔徑太小，電泳時樣品分子不能進入凝膠。濃度太小，孔徑太大，則樣品中各種蛋白分子均隨著緩沖液流向前推進而不能得以很好地分離。

凝膠濃度的選擇PAGE膠的孔徑隨

“Bis～Arc〞

比率的增加而變小，比率接近

1：20

時孔徑到達最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“Bis～Arc〞

為1：29

配制，研究說明它能別離分子量大小相差只有3%

的蛋白質。凝膠濃度與蛋白別離范圍對于具有不同遷移率的多組分樣品，很難選擇一種濃度的凝膠來分離，此時最好使用梯度膠。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200一般來說，在被分析的蛋白質穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用。最常見的凝膠電泳緩沖液由Tris-甘氨酸或

Tris-tricine組成。

分離很寬分子量范圍（6-200KD）的蛋白質適于分離小分子蛋白質（10KD）電泳緩沖系統(tǒng)蛋白分子量標準

(marker)

未染色marker

是最簡單,最準確的marker。由于沒有附帶染料分子或者是標記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。

現(xiàn)在的Marker多數(shù)都選用預混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。

預混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，以方便辨認寬分子量蛋白標準高分子量蛋白標準低分子量蛋白標準預染蛋白分子量標準

預染蛋白分子量是純化好的蛋白混合物，與染料共價耦聯(lián)。優(yōu)點：及時監(jiān)測電泳情況和估計遷移率直接觀察蛋白轉膜效率可以在膜上標記蛋白分子量缺點：預染Marker與染料共價耦聯(lián)，電泳時遷移特性可能會發(fā)生改變，不適合精確定位蛋白通常預染marker的條帶和目標蛋白不完全一樣，只是參考大小，在不需要區(qū)分大小相近的條帶時，預染Marker很方便實用。預染蛋白標準可以分為兩種：單色預染和多色預染注意：由于轉膜是一個將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上，所以需要的marker上樣量相對較少，但要在電泳過程中看到預染Marker，常需要比說明書里多加一些Marker。

優(yōu)點：1.包裝方便攜帶和使用常溫儲存在48孔板中，使用不需解凍，只需用槍頭刺穿外層薄片，將槍頭中的10ul去離子水注入Marker干粉中吸起來就可使用2.獨立包裝可以防止污染3.分子量范圍較廣，從18.5kD到215kD〔4-20%SDS〕4.凝膠上和轉移膜上各條帶分布水平和顯色水平一致5.可用于染色〔考馬斯亮藍染色和銀染〕。BlueRangerPrestainedProteinMWMMix（Pierce產(chǎn)品）：110元／次單色預染的極品內(nèi)參照（Loadingcontrols）電泳步驟1.試劑準備

需要注意的事項：Arc和Bis的有效性

AP的有效性2.玻璃板的準備

制膠架注意滲漏3.配膠和灌膠積層膠和分離膠梳子及其選擇凝膠濃度的選擇：根據(jù)目的蛋白的分子量要考慮的因素：溫度需要注意的事項：過硫酸胺最后加氣泡別離膠不要灌得太滿。gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好?；旌蠑嚢杷俣纫m當，太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導致電泳帶畸形；太慢不均勻。注意事項4.樣品準備和點樣

樣品按1:1加入2xSDS加樣緩沖液，煮沸3-5min。注意水蒸氣的小問題分子量標準內(nèi)參陽性對照5.電泳

積層膠：低電壓分離膠：高電壓注意電泳時間，當溴酚藍指示到凝膠盡頭時停止。

注意正負極影響電泳效果的因素：1.電壓低電壓會使膠的分子篩效應得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮。2.膠的均勻度膠越均勻，條帶越窄，別離越均勻。︶條帶呈笑臉狀凝膠冷卻不均勻，中間冷卻不好︵條帶呈皺眉狀可能凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，兩邊聚合不完全拖尾樣品溶解不好紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜條帶兩邊擴散加樣量過多電泳中出現(xiàn)的現(xiàn)象及原因

電泳結果檢查：考馬斯亮藍染色：使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染：操作復雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。以上兩種染色方法染料與蛋白不可逆結合，干擾后面的WesternBlot實驗，可選擇同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉膜半干法將凝膠和固相基質象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉10－30min。濕法將凝膠和固相基質夾在濾紙中間，浸泡在轉移裝置的緩沖液中，電轉45min或過夜。

三、蛋白質轉移(轉膜)轉膜方法選擇原那么：a.膜與目的蛋白的結合能力〔單位面積的膜結合蛋白的載量〕以及膜的孔徑〔攔截蛋白的大小〕；b.不影響后續(xù)的顯色檢測〔適和用于所選的顯色方法，信噪比好〕；c.根據(jù)不同目的來挑選不同的轉移膜，如要做蛋白測序或者質譜分析。

轉印膜常用的固定化膜：NC膜（硝酸纖維素膜）和PVDF膜。1.

蛋白印跡最廣泛使用的轉移介質，對蛋白有較強的結合能力〔80－100ug/cm2)。2.適用于各種顯色方法，同位素，化學發(fā)光〔Luminol類〕、常規(guī)顯色、熒光顯色；3.背景低，信噪比高。4.轉移到NC膜上的蛋白在適宜的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間。Schleicher&Schull公司的實驗說明，轉移到NC膜上的蛋白4℃條件下保存5年依然保持免疫識別特性，可以得到清晰可信的WesternBlot結果。優(yōu)點

硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜)

純的硝纖膜較脆，易卷，不適合用于需要屢次重復清洗的用途缺點注意1.硝纖膜孔徑選擇：>20KD蛋白：選擇0.45um孔徑的膜，<20KD蛋白：選擇0.2um的，<

7KD蛋白：選擇0.1um的膜。2.選擇純的NC膜（混有含醋酸纖維（CM）的NC膜結合力會降低）。3.選擇合適的去垢劑：NC膜上結合的蛋白會因為某些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%

常見生產(chǎn)公司：Schleicher&SchullMilliporePALL羅氏InvitrogenGE〔Amersham〕SantaCruz均有NC產(chǎn)品Schleicher&Schull是第一個提供硝纖膜的廠家，其NC膜分為純NC膜和強化NC膜兩種：

ProtranNC膜OptitranNC膜Protran特點：100%PureNC，蛋白結合能力強低背景、多孔徑選擇（0.45,0.2,0.1um）保存時間長（實驗證明膜上蛋白辨認時間可長達5年）純NC膜，比較脆，機械耐受力欠佳，需小心操作Schleicher&Schull”“王牌“產(chǎn)品——純NC膜

Optitran：在超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素，外表和純NC膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點，內(nèi)部多了中性支持物，其柔韌度和機械耐受力高于NC膜，不容易卷曲，特別適于重復標記和洗脫的實驗。蛋白結合力不如純NC膜結合能力強(75-90μg/cm2)

。Schleicher&Schull的強化NC膜PVDF膜

做WB的“殺手锏PVDF:聚偏二氟乙烯膜,作為基質的轉印膜由Millipore公司在1985年首先推出。PVDF膜的蛋白質截留能力，機械強度和化學相容性都強于NC膜。PVDF膜結合量是100-200μg/cm2，而結合強度PVDF比NC膜高6倍！PVDF膜特點：

1.更好的機械強度和化學耐受性。

2.適用多種檢測方法：化學發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標準染色都可以，但不適合熒光。3.膜孔徑有0.45um和0.2um，后者對小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會比前者稍高。PVDF膜需要100%甲醇預處理（不超過15秒）MiliporePVDF:20*20cm(2400元/10張)BioRedNC膜：30cm*3.5m（2200元/卷）活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分為：Immobile-P〔0.45um〕：孔徑均一，蛋白吸附力強，染色性能好、抗溶劑能力強和信噪比高。Immobilon-PSQ(0.2um)：是印跡小分子蛋白質〔<20KDa〕的理想選擇——優(yōu)良的蛋白質吸附性能，滲漏少。Immobilon-FL(用于熒光顯色)第一個專門為熒光顯色優(yōu)化的轉移膜。BlottingSandwichesforHighTroughput四種。

這幾種膜最大特點——快。按照Millipore的操作手冊，Immobilon可以在保證質量的前提下縮短WB時間到2個小時——主要是縮短封閉和洗脫時間。

尼龍膜更多是用于核酸的轉移，也有見于蛋白印跡，比方dotblot優(yōu)點〔相對NC膜〕1.結合力強，2.機械強度大，結實，柔軟且不易卷曲，便于操作缺點：1.背景高——由于尼龍膜電荷密度高，使得非結合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對于靈敏度高的檢測方法，背景問題尤為突出2.當轉移緩沖液中存在有SDS時蛋白質容易從尼龍膜上泄漏〔通過甲醛固定可以緩解這一情況〕。3.無適合尼龍膜上的直接染色方法。目前WB實驗多不選擇尼龍膜。

尼龍膜轉移緩沖液緩沖液的組成對蛋白與膜和探針的結合起著決定的作用。

為了得到最有效的轉移，不但必須有足夠的時間，緩沖液的pH和離子強度還必須使蛋白質有最大的可溶性和轉移速度。

目前通常使用Tris-甘氨酸緩沖液。

若轉膜后有樣品要測序，最好用CAPS緩沖液，減少甘氨酸對測序的污染。TransferBuffer:48mMTrisbase5.81g39mMGlycine2.93g0.037%SDS0.375g20%MeOH200mltotal1000mlNotes1.全程手套操作，防止手印污染也保護自己2.做好標記，以免轉摸后分不清條帶泳動方向及加樣孔順序。3.對于特別小的蛋白，tricine(兩性離子緩沖劑)SDS電泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD間的分辨率。4.轉膜前膠要在轉移緩沖液里平衡一下防止膠變形，有助于進一步去掉可能有礙轉膜的雜質。5.讓電轉液從下通過膜以趕走膜內(nèi)空氣，膜需要徹底浸潤否那么影響轉膜效果。6.膜不要用考馬斯亮藍或者氨基黑染色,可以用麗春紅S染色.

可逆染液：ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等染色后，染液可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析

不可逆染液：

考馬斯亮蘭、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于進一步的分析。轉膜后檢測免疫學基礎抗原抗體反應抗體起到探針的作用，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應。多克隆抗體單克隆抗體信號強度較好視不同抗體而異特異性良好，但有一定的背景最佳，但有交叉反應優(yōu)點多數(shù)能識別變性抗原特異性好缺點不易重復，有時背景較深多數(shù)不能識別變性抗原四、免疫檢測同位素標記生物素標記地高辛標記酶標記

酶標底物：生色底物化學發(fā)光法底物熒光底物抗體標記方法酶標記法安全且快速，已經(jīng)成為WesternBlot的主流檢測方法。酶促反響的底物不同顯色方法不同：化學發(fā)光Chemiluminescent：靈敏度很高，靈敏度已經(jīng)到達pg級別，甚至還有Femto級別的，靈敏度超過了同位素底物顯色Colormetirc/Chromogen：直接顯色而操作簡便且本錢低。主要有：辣根過氧化物酶HRP〔HorseradishPeroxidase)堿性磷酸酶AP〔AlkalinePhosphatase〕

葡萄糖氧化酶〔GlucoseOxidase〕β-半乳糖苷酶〔β-Galactosidase〕少見常見酶標記法生色底物檢測

HRP的顯色底物有：

DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride,3’3’二氨基聯(lián)苯胺)

4-CN(4-Chloro-1-naphthol,4-氯-1-萘酚)CN/DAB

AEC(3-amino-9-ethylcarbazole,3-氨基-乙基咔唑)，

TMB(3.3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,3.3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺)

辣根過氧化物酶（HRP）底物顯色是利用底物在HRP和H2O2存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累這一過程檢測WB的結果。

HRP底物DAB4-CNAECTMB分子量214.14178.58210.28240.4穩(wěn)定性好一般避光好靈敏度250pg1ng

100pg背景

一般低高高終產(chǎn)物成像性

不能很好的成像容易成像容易成像顏色褐色介于藍色與藍紫色之間（可用于double-staining）紅色藍紫色毒性有（疑有治癌作用）無有無ACE各方面性質與DAB相似，但靈敏度要比DAB稍差信噪比高，成分安全，特別合適于靈敏度要求高的WB，但由于靈敏度高而易引起高背景，以相應的延長封閉的時間和注意洗滌的次數(shù)DAB顯色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的廠家推出DAB+4-CN混合底物，結合了DAB靈敏度高和4-CN背景低，易成像的優(yōu)點，能獲得很好的黑色沉淀成像。用金屬離子增強信號的DBA顯色試劑靈敏度可以高達20pg。AP——堿性磷酸酶堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法AP可將無色的底物BICP（5－溴－4－氯－吲哚磷酸鹽）轉化為藍紫色產(chǎn)物AP很早就被用于檢測系統(tǒng)——包括WB檢測和核酸檢測。優(yōu)點：靈敏度高底物更穩(wěn)定〔試劑盒保存時間長〕缺點：顯色背景偏高〔脫脂奶粉和BSA中富含AP〕。分子克隆III推薦的適用AP封閉劑是：6%的酪蛋白1%聚乙烯吡咯烷酮10mmolEDTA

65度加熱1小時確保AP失活后再用于封閉。BCIPNBTBCIP/NBTBCIP/INT學名,5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphatetoluidinesalt四氮唑藍nitro-bluetetrazoliumchloride碘硝基四唑紫Iodonitrotetrazolium作用與O2反應形成沉淀氧化反應BCIP用NBT作為電子受體氧化反應靈敏度100pg100pg30pg一般沉淀顏色紫色藍紫色藍紫色棕紅色用途AP顯色AP或者葡糖氧化酶AP，原位雜交和免疫組化AP和免疫組化AP顯色底物AP顯色的靈敏度就可以達到低pg級，但封閉要做得好BCIP/NBT靈敏度最高，顯色也比較銳利，成像性比較好，最常用到

化學發(fā)光檢測化學發(fā)光法是目前使用最為廣泛，平安好且靈敏度極高的WB檢測方法。該方法在酶和底物都存在時才發(fā)光，不同于生色反響形成不溶的產(chǎn)物累積于膜上，所以特別適合同一張膜對不同的目標蛋白分別進展屢次檢經(jīng)常使用的顯色交聯(lián)酶：HRP和AP抗體濃度過高造成高背景——所以抗體用量的稀釋倍數(shù)要大HRP化學發(fā)光底物經(jīng)典底物：Luminol辣根過氧化物酶-ECL法:

利用辣根過氧化物酶催化化學發(fā)光物質（魯米諾）,生成一種不穩(wěn)定的中間物質,其衰變時在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學發(fā)光帶,在化學增強劑存在的情況下，光強度可增強1000倍。利用X線膠片感光原理,將結果記錄下來ECLECLPlusECLAdvanceRecommendedapplicationsRoutineWesternblottingHighsensitivityWesternblottingandchemifluorescentdetectiononscannersHighestsensitivityWesternblottingprimaryantibodyand/ortargetisverylowabundanceSensitivityUpto10-12gUpto20timesgreaterthanECLUpto10timesgreaterthanECLPlusAntibodyeconomyGoodVeryGoodOutstandingPrimaryantibodyUpto1:10000Upto1:20000Upto1:100000SecondaryantibodyUpto1:15000Upto1:200000Upto1:500000BlockingAgentincludedCertainsystemsCertainsystemsYes-ECLAdvanceBlockSimplereprobingprotocolsYesYesYesEmissionduration1-2h24-18h4-6hGEHealthcare公司的ECL新產(chǎn)品

AP在催化脫磷底物方法時轉換數(shù)高,可快速產(chǎn)生強信號,獲得極高靈敏度的WB結果。WesternBreeze化學發(fā)光法檢測試劑盒〔Invitrogen公司產(chǎn)品〕〔1〕檢測靈敏度到達Femto水平〔2〕發(fā)光持續(xù)時間長達5天?！?〕兼容成像系統(tǒng)，〔4〕優(yōu)化后背景極低，Lumi-PhosWb化學發(fā)光法檢測試劑盒〔Pierce公司產(chǎn)品〕〔1〕靈敏度可以到達低pg級——1～2pg〔2〕檢測方法適用的膜還包括尼龍膜——這是許多化學發(fā)光底物所不兼容的〔3〕發(fā)光持續(xù)時間是8個小時〔2小時內(nèi)光最強〕AP化學發(fā)光免疫檢測步驟1.封閉5%脫脂奶粉（溶于TBS緩沖液）

目的：封閉膜上未結合蛋白的位點Note：脫脂奶是最常用的經(jīng)濟配方，但其可能有痕量的生物素和AP，可造成背景污染而不適合生物素—親和素的檢測方法

采用AP檢測系統(tǒng),脫脂奶不適合用做封閉液。若用HRP檢測系統(tǒng)則封閉液不要加NaN3，它對HRP有滅活作用，選用AP作為顯色方法，封閉時要選擇Tris緩沖體系，不要用PBS封閉時間和封閉劑的量都要足夠。2.一抗溫育5%脫脂奶粉+適量一抗平緩搖動溫度時間目的：一抗和目的蛋白結合3.洗膜

用含TWEEN-20的TBS緩沖液洗少量多次

目的：洗去未與目的蛋白結合的一抗4.二抗溫育

5%脫脂奶粉+適量二抗平緩搖動溫度時間

目的：二抗和已與目的蛋白結合的一抗結合起放大作用5.洗膜

用含TWEEN-20的TBS緩沖液洗少量多次

目的：洗去未與一抗結合的二抗6.檢測：

辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發(fā)光顯色法(HRP)

8.灰度分析

灰度分析軟件MetaMorphoffline分析軟件；PhoretixD6.01，PDQuest7.3.1

目的：得到目的蛋白質的相對含量WesternBlot常見問題分析實驗中可能出現(xiàn)的問題1.沒有注明可以用來做westernblot的一抗，可以用來做westernblot嗎？不一定