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關(guān)于人類細(xì)胞質(zhì)的提取等Contents1.人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取2.RT-PCR的原理、方法3.瓊脂凝膠電泳結(jié)果分析及應(yīng)用第2頁,共20頁,2024年2月25日,星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取
真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA(80-85%)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA(1-5%)組成,其rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。
第3頁,共20頁,2024年2月25日,星期天
人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取·分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況·獲得新基因AIMS·研究基因的拼接·分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物第4頁,共20頁,2024年2月25日,星期天
人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取原理:RNA的不穩(wěn)定性
由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基,RNA易于被RNA酶切割水解
RNA酶含量豐富,加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性,不易失活。所以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性,從而達(dá)到成功提取RNA。第5頁,共20頁,2024年2月25日,星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取常用RNA酶抑制劑:
焦碳酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。
異硫氰酸胍:目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。
氧釩核糖核苷復(fù)合物:由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物,它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活。第6頁,共20頁,2024年2月25日,星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取
RNA提取的一般步驟:破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA
破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎組織加入β-巰基乙醇可以抑制RNA酶活性
分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑,加入少量異戊醇,經(jīng)過此步,離心,RNA一般分布于上層,與蛋白層分開
沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc(pH=5.2)或異丙醇。
第7頁,共20頁,2024年2月25日,星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提?、芟礈霷NA使用70%乙醇洗滌,有時,為避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能過于干燥,否則不易溶解⑤融解RNA一般使用TE(三羥甲基氨基甲烷和EDTA配置而成)⑥保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase(核糖核酸酶)的污染,從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA,對于長期貯存也應(yīng)該如此第8頁,共20頁,2024年2月25日,星期天
RT-PCR
的原理及方法
RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄PCR,或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。第9頁,共20頁,2024年2月25日,星期天
RT-PCR
的原理及方法
背景
基因的表達(dá)
*不同細(xì)胞或組織表達(dá)不同的基因基因組DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白質(zhì)產(chǎn)物第10頁,共20頁,2024年2月25日,星期天RT-PCR
的原理及方法目的通過反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,RT)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)的方法,檢測目的基因在特定組織或細(xì)胞中、mRNA水平的表達(dá)豐度第11頁,共20頁,2024年2月25日,星期天RT-PCR
的原理及方法原理及方法mRNA
(messengerRNA)cDNA(complementaryDNA)
PCR產(chǎn)物RT(反轉(zhuǎn)錄)
PCR(聚合酶鏈反應(yīng))第12頁,共20頁,2024年2月25日,星期天RT-PCR
的原理及方法第13頁,共20頁,2024年2月25日,星期天Diagram第14頁,共20頁,2024年2月25日,星期天瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法,借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用,核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同,電泳速度有差異而分離,這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。第15頁,共20頁,2024年2月25日,星期天瓊脂糖凝膠電泳TEXTTEXTTEXTTEXT原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠,不同的RNA條帶也能分開,但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下,RNA的泳動率才與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定RNA分子量時,一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時,配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可第16頁,共20頁,2024年2月25日,星期天瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測
在基因組DNA的提取中,用蒸餾水溶解提取出的DNA,在1.0%的瓊脂糖膠進行電泳,以Marker(分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))作為參照,用≤5V/cm的電泳30-60分鐘,最后采用EB溶液進行染色后在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察拍照。第17頁,共20頁,2024年2月25日,星期天瓊脂糖凝膠電泳
應(yīng)用(廣泛應(yīng)用與分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué))分離提取大分子DNA可區(qū)分相差100bp的DNA片段測定糖化血紅蛋白PCR擴增產(chǎn)物的檢測免疫擴散法利用瓊脂糖凝膠作為擴散介質(zhì),使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴散而相遇,從而形成抗原抗體復(fù)合物第18頁,共20頁,2024年2月25日,星期天
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