高效液相色譜柱

高效液相色譜柱參與者：賴云飛、曾麗華、李菁、吳海霞、劉佳、徐玲霞01高效液相色譜柱的結(jié)構(gòu)02高效液相色譜柱的分類與應用范圍03品牌色譜柱廠家、型號04高效液相色譜柱使用注意事項目錄1.液相色譜柱的結(jié)構(gòu)液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲與柱填料等組成柱管：多用不銹鋼制成，如果使用時柱壓不高于70kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。多孔燒結(jié)物（濾片）：封閉色譜柱的兩端，固體色譜柱的填料。一般來說，5um與3um的微粒分別用2um與0.5um孔徑的不銹鋼濾片。密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。柱填料：色譜柱擔體，常用的填料為硅膠、多孔聚合物、氧化鋁等；2.液相色譜柱的分類與應用范圍分類方法很多，可按鍵合相類型、用途（分析型與制備型）、基質(zhì)種類等進行分類。硅膠基質(zhì)柱（4大類）：

目前，分析型液相色譜柱多為硅膠基質(zhì)柱，細分為：高純硅膠柱：以高純度硅烷化硅膠（Silica）為填料，應用范圍較廣，但只能在PH2.0-7.5，小于60度的條件下使用。又由于強極性硅羥基（Si-OH)的次級保留效應較強，所以應用受到局限，已被鍵合相柱所取代。反相硅膠柱：是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，表面鍵合弱極性官能團的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（phenyl，苯基）等。用于分離大多數(shù)有機化合物，應用范圍最廣。正相硅膠柱：是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，表面鍵合極性官能團的固定相。目前較多的為：NH2—（氨基）、CN—（氰基）、DIOL（二羥基，也常做HILIC單獨分類列出，多用于分離有機酸、蛋白質(zhì)等）。多用于分離光學異構(gòu)體和反相柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì)。離子交換柱：是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，以磺化交聯(lián)鍵合強陽/陰離子基團（磺酸鹽/季銨堿）的固定相，又分為強酸性、強堿性、弱酸性、弱堿性等不同規(guī)格。用于分離解離性較強的有機鹽類化合物。（注意：不要同離子色譜混淆，離子色譜主要是分離無機鹽類化合物或某些帶點離子。）聚合物基質(zhì)柱

聚合物基質(zhì)柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝膠作為主要填料的一類色譜柱。其相對于硅膠柱具有更強的疏水性及更寬泛的pH范圍（1.0～14.0），但柱效較低，目前主要應用于凝膠滲透色譜（GPC）、凝膠過濾色譜（GFC）及分子排阻色譜（MEC）。主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物。其他無機物填料柱這類色譜柱僅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化鋁（Al2O3）、氧化鋯（ZrO2）等填料。不需要進行表面改性，其自身表面即可對各類化合物有強保留?？稍谌我鈖H（氧化鋁除外，不能大于12.0）及高溫度（可達100℃）下使用。其中，石墨化碳填料柱能分離多種化合物，主要用于分離幾何異構(gòu)體；氧化鋁柱剛性強，柱床穩(wěn)定，可分離多種化合物且多用于制備色譜；氧化鋯柱較氧化鋁柱有更強的pH適用范圍及能耐受更高的溫度，但其應用尚待進一步研究。建立色譜柱檔案在實驗室內(nèi)的色譜柱應該進行統(tǒng)一標號，收納進倉庫中，然后關(guān)于色譜柱的建立紙質(zhì)版以及電子版檔案，檔案中色譜柱的信息一定要添加完整，為以后積累色譜柱的適用信息提供參考，這其中應該包括：色譜柱的編號、品牌、填充材料、型號、正在運輸中的溶劑、最大耐壓值及流速、最佳使用溫度范圍、PH值范圍、需要注意的事項、產(chǎn)品序列號以及備注信息等.常用液相色譜柱主要應用范圍與特點匯總反相色譜柱柱填料類型主要應用范圍特點C18（ODS）可分離多種化合物，最適合用于極性樣品或做離子抑制的樣品的分析

普適性好；保留性強，用途廣

；可用于正相。C8（辛基）

與C18相似與C18相似，但保留值稍小C3，C4

多用于肽類與蛋白質(zhì)

保留值更小

C1[三甲基單氯硅烷(TMS)]普通反相溶劑分析疏水性強的化合物；使用高水含量溶劑分析高極性化合物

；分離多功能團化合物保留值最??；最不穩(wěn)定；可用于反相與正相

苯基，苯乙基

多用于分離分析同時含極性和非極性芳香化合物的混合物

保留值適中；選擇性有所不同

，對極性芳香化合物選擇性更強；可用于正相。正相色譜柱柱填料類型主要應用范圍特點CN（氰基）

適用于在ODS上無保留或分離時間太長的組分的分離，以及樣品中同時含有親水與疏水性化合物而在ODS上色譜優(yōu)化困難的場合，也可用于氨基酸分析。屬中等級性柱，普適性好；保留適中，可用于正相與反相。

NH2（氨基）

主要用于分析單糖類、烴類化合物保留性弱；極性大，不穩(wěn)定，酸性條件下易水解；亦可用于反相。OH（二醇基，DIOL）

多用于有機酸、肽類與蛋白質(zhì)分析

極性大于CN，小于NH2，常做HILIC用?？煞聪嘤?。高純硅膠柱多用于制備LC，適用于多種化合物普適性好；價廉；操作不太方便；pH窄（2-7.5）；次級保留效應強（硅羥基），易峰拖尾或前延，分叉等。柱填料類型主要應用范圍特點Chiral（手性柱）

常用于分離手性異構(gòu)體，根據(jù)分離不同機理選擇。不同化學性質(zhì)的異構(gòu)體需采用不同類型的手性柱

。部分亦可用于反相。HILIC（親水作用柱）最常用Diol柱、丙基酰胺基鍵合硅膠柱，多用于分析極性化合物、端基異構(gòu)體、如藥物極性代謝產(chǎn)物、多肽、有機酸、糖類等。多用于ELSD檢測，C18無保留化合物，毒品檢查等?？捎糜诜聪唷＞酆衔锘|(zhì)柱

單獨的聚苯乙烯類填料柱主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若與離子交換基團共鍵則形成離子交換柱，用于分離酸性化合物（磺酸基團）、堿性合物（季銨基團）及藥物代謝產(chǎn)物等。特點：在1＜PH＜13的流動相中穩(wěn)定；分離峰形較好，柱子壽命較長。其他無機物填料柱如氧化鋁、石墨化碳、氧化鋯、硅藻土等，主要作制備色譜用。

液相色譜柱分離機理概述

色譜柱類型分離機理備注常規(guī)反相柱相似相溶常規(guī)正相柱相似相溶離子交換柱樣品離子與色譜柱離子達到置換動態(tài)平衡要關(guān)注pH條件手性柱（Chiralcolumn）氫鍵作用、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用、空間作用

一般，AGP、HSA、BSA等以疏水作用、空間作用為主

。親水性色譜柱（HILIC）氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級效應及相似相溶氨基酸分析柱相似相溶3.品牌色譜柱廠家、型號實驗室常用色譜柱有C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、氨基柱、手性柱、離子交換柱；Waters公司的μBondapak系列填料柱(分析柱部份產(chǎn)品節(jié)選)安捷倫公司的Zorbax系列填料柱

YMC公司的pack系列填料柱其他品牌：

美國Supelco公司的Supelco柱,瑞典AkzoNobel公司的Kroma-sil填料柱，迪馬公司的Diamonsil柱以及部分日本島津公司的產(chǎn)品，此外Merk公司和Mecherey-Nagel公司也是世界知名的色譜填料和色譜柱生產(chǎn)廠家。4.高效液相色譜使用注意事項普通C8及C18反相色譜柱（C8&C18Reversed-phasechromatographycolumn）當色譜柱使用較長時間之后，就可能發(fā)生柱壓升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等情況，這時就需要根據(jù)故障原因?qū)ιV柱進行清堵與再生，以延長色譜柱的使用壽命。具體原因及處理方法如下：（1）篩板堵塞與柱頭塌陷：主要現(xiàn)象有柱壓嚴重升高或不穩(wěn)定、色譜峰拖尾、色譜峰變寬、色譜峰分叉、禿峰等，需要進行清堵與彈性復原處理。（此方法適合于任何類型有相同故障的色譜柱的處理，不同的是溶劑要與相應類型色譜柱匹配。）主要處理方法如下：①一般情況下，將色譜柱反接，不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速沖洗約4h→再正向連接，接或不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速沖洗約1h→再提高流速至1.0ml/min沖洗1h，觀察柱壓變化。若不湊效，則擰開柱頭螺母（色譜柱進口），小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20min左右，再用純水超聲20min左右。用小勺清理掉柱進口污染的部分填料，再將用乙醇調(diào)和后的相應的硅膠裝入柱入口（也可用已經(jīng)報廢的同類柱中的填料替代），用平面不銹鋼小鏟壓緊填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否則，壓得太緊柱壓會升高，然后裝上清洗過的篩板，注意篩板安裝方向必需與原裝相同，最后緊固。②沖洗與飽和：清堵緊固后，先反向連接色譜柱，不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速沖洗約4h→再換成甲醇以0.5ml/min流速沖洗約2h→再正向連接色譜柱，接或不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速沖洗約2h→再換成甲醇以0.5ml/min流速沖洗約1h→然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速沖洗約1h以上，再根據(jù)測試用流動相比例調(diào)整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速沖洗約1h，最后用測試用流動相平衡2h，進樣測試即可。③特別說明：如不是特殊情況，按其他辦法可行，則最好不要反沖色譜柱和拆卸篩板。（2）柱效降低：主要特征性現(xiàn)象有柱壓基本正常，但出現(xiàn)拖尾峰、禿峰、分叉峰、前延峰、峰變寬、基線漂移、理論板數(shù)降低、分離度降低等。需要進行再生處理，具體方法如下：①一般情況下，順接色譜柱，按如下溶劑順序及條件沖洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml/min，1h以上）→75％乙晴-25％異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上，根據(jù)實際情況可忽略）→100%異丙醇（0.5ml/min，20倍柱體積以上）→95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱體積以上）→檢測用流動相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進樣測試。在沖洗過程中，隨時關(guān)注柱壓變化，確保不超過4000psi；若超出，可通過降低流速，升高柱溫來調(diào)整，具體操作可咨詢具備相關(guān)專業(yè)知識背景和實踐經(jīng)驗的人士。②若上述方法效果不理想，可按如上溶劑順序和條件，先反接色譜柱沖洗→再順接色譜柱，用100%乙腈以1ml/min流速沖洗約2h→再用與流動相同比例的水-有機相以1ml/min流速沖洗約30min→最后用流動相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進樣測試即可。③特別說明：再生過程必須隨時關(guān)注柱壓變化，柱壓過高易導致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時要保證再生時間足夠。（3）當分析復雜樣品時間過長，尤其是中藥分析，若出現(xiàn)柱壓正常而色譜峰形變差，分離度降低時可嘗試如下方法再生：先用5%甲醇（或乙腈）-95%水，將色譜柱反向連接，以1ml/min沖洗60分鐘以上→再用四氫呋喃（或丙酮）以0.5ml/min沖洗60分鐘以上（去除脂類）→再用65%甲醇（或乙腈）-35%水，以流速1ml/min沖洗60分鐘→然后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘→接著用與流動相同比例的水-有機相以1ml/min流速沖洗約30min→最后用流動相平衡2h，進樣測試即可。（4）特別提醒：再生時最好選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統(tǒng)色譜儀器進行，以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。正相色譜柱（Normal–PhaseChromatographycolumn）氨基柱（-NH2）①在正相條件下使用時，故障率較低。但要注意不可進樣含有醛基、羰基的化合物，不可用于還原糖的分析；流動相要徹底脫氣，并不得含有羰基化合物和過氧化物（質(zhì)量較差的乙醚、四氫呋喃等溶劑中含有少量）。任何時候更換流動相時都要確保新流動相與柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用異丙醇過渡。

當使用氨基柱進行酸性物質(zhì)分析時，酸性物質(zhì)溶液有質(zhì)子存在，會使略帶負電荷的氨基官能團質(zhì)子化，導致使用一段時間后被測成分保留性質(zhì)有所改變或柱效下降。這時，建議按如下方法處理：首先用異丙醇，以0.5ml/min流速，沖洗約50倍柱體積→然后用甲醇，以0.5ml/min流速，沖洗約50倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速，沖洗約10倍柱體積過渡，回到平常使用的正相流動相平衡2h，進樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試按以下程序沖洗與再生：

首先用含0.5%～1.0％NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速沖洗該柱約5～10倍柱體積→然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速沖洗該柱約5～10倍柱體積以洗去多余NH3→再用添加少許NH3（如0.1％）的酸性分析物的流動相平衡2h左右，進樣檢測即可。②在反相條件下使用時，-NH2鍵會水解，尤其是在該柱子pH范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會下降很快，所以故障率較高。若出現(xiàn)柱壓增高柱效降低等情況，建議采用如下方法處理：若流動相含有緩沖鹽，先以流動相比例的水-有機溶劑，以檢測分析時同流速沖洗約30倍柱體積→再用純甲醇，以1.0ml/min流速沖洗約50倍柱體積→然后用異丙醇，以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積過渡→再用二氯甲烷以0.6ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積過渡回到甲醇條件下，以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積，密封保存或用流動相平衡2h左右（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：95％水-5％乙腈，以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→THF（四氫呋喃），以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積→95％乙腈-5％水以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→保持95％乙腈-5％水，以低流速0.2-0.5mL/min沖洗過夜→流動相平衡2h（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗30min），進樣檢測即可。氰基柱（-CN）①在正相條件下使用時，故障率較低，操作和維護與氨基柱基本完全相同。但當柱子使用一定時間后，若出現(xiàn)柱效下降，柱子老化，可通過沖洗再生來恢復其柱性能。具體方法如下：用氯仿以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用異丙醇以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→然后用二氯甲烷以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用流動相（pH1.5-7.0為佳）平衡1h，待基線平穩(wěn)，進樣檢測即可。②在反相條件下使用時，-CN鍵會水解，尤其是在pH1.5-7.0范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會下降很快，所以故障率較高。如果在這個條件下使用，一定要注意及時清洗。若出現(xiàn)柱效下降，柱子老化，可通過沖洗再生來恢復其柱性能。具體方法如下：若流動相含有緩沖鹽，先以流動相比例的水-有機溶劑，以檢測時同流速沖洗約30倍柱體積→再用95%水-5%乙腈以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用THF（四氫呋喃）以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用95%乙腈-5%水以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用流動相平衡2h（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：用95%水-5%乙腈以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用THF（四氫呋喃）以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用95%乙腈-5%水以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→保持95%乙腈-5%水繼續(xù)沖洗，以低流速0.2～0.5mL/min沖洗過夜→流動相平衡2h（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。陰/陽離子交換柱陽離子交換柱常見故障與處理離子交換柱屬于較脆弱的色譜柱，陽離子交換柱在使用過程中，往往會由于不規(guī)范操作而導致一系列故障。常見故障如下：①柱壓升高伴隨柱效降低：主要是由于系統(tǒng)管路或柱保存過程中柱內(nèi)或長菌、樣品溶液中的顆粒物積聚在燒結(jié)物或者柱床上等所致。②色譜峰額外地展寬：主要是由于管路太長、非新鮮配制的流動相中含有不正確的陰離子、流動相pH與離子強度不正確、用流動相平衡時間不夠等所致。③柱壓正常伴隨柱效降低：主要是由于樣品中有脂肪，油脂，脂質(zhì)等有機物致使固定相的表面被覆蓋、從樣品中帶來的不確切的有機物或未正確制備洗脫液、在洗脫液制備完成以后帶入洗脫液中的非特定有機物（eg.運輸時從大氣中帶來）。針對上述情況，在使用離子交換柱過程中需特別注意即可避免。若已經(jīng)產(chǎn)生故障，可根據(jù)實際情況處理，嘗試按如下方法再生：首先反接色譜柱→用1mol/L的硝酸銨溶液，以0.4ml/min的流速洗脫30ml～60ml→再用甲醇-水（40：60），以0.4ml/min的流速洗脫30ml～60ml→然后用異丙醇，以0.4ml/min的流速洗脫30ml→再用去離子水，以0.4ml/min的流速洗脫30ml→然后用檢測用洗脫液，以0.4ml/min的流速洗脫30ml→最后將柱子接回正常方向，用檢測用洗脫液平衡至基線平穩(wěn)，進樣檢測即可。陰離子交換柱常見故障與處理同陽離子交換柱。不同的是，陰離子交換柱在不正確的較低pH條件下會導致系統(tǒng)峰（溶劑峰+硫酸鹽峰）逐漸前移和峰向（正與負）針針變化。處理：正確配制新鮮的pH在3.8-4.3之間的洗脫液。若出現(xiàn)與陽離子交換柱相同的常見故障，處理方法同陽離子交換柱。部分離子交換柱要求不同可采用0.05mol/L的硫酸溶液（陽離子交換柱）或0.05mol/L的氨水溶液（陰離子交換柱），反向連接色譜柱，以0.3ml/min流速過夜沖洗→換成去離子水，以0.5ml/min流速，沖洗約12h→再正向連接色譜柱，用流動相平衡至基線穩(wěn)定（若流動相中含有緩沖鹽，需先用超純水以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積，再進行平衡），進樣測試即可。手性柱（ChiralHPLCColumn）手性色譜柱在使用過程中往往會由于操作不當而導致一系列問題，現(xiàn)以AGP柱為例加以說明和規(guī)范。（1）常見故障原因及處理辦法：①手性異構(gòu)體無法完全分離：多為色譜條件不妥，需要重新考察色譜條件。②峰形變差，諸如拖尾、分叉、前延：多為色譜柱污染、柱床硅膠溶解與柱頭塌陷（往往是由于流動相pH超過8.0