微生物細胞的破碎

關(guān)于微生物細胞的破碎微生物代謝產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物大多數(shù)小分子代謝物細菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶霉菌產(chǎn)生的糖化酶大多數(shù)酶蛋白類脂部分抗生素第2頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共78頁，2024年2月25日，星期天分離提取胞內(nèi)產(chǎn)物時，首先必須將細胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進一步分離、純化，因此細胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵步驟。第4頁,共78頁，2024年2月25日，星期天細胞破碎是指選用物理、化學、酶或機械的方法來破壞細胞壁或細胞膜，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來的方法。細胞壁的破碎最為關(guān)鍵，這是因為：1）細胞壁是具有一定剛性和堅韌的物質(zhì)，起到保護細胞的作用。2）細胞壁具有抗機械撞擊的作用。第5頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.1細胞壁結(jié)構(gòu)和化學組成細胞壁的化學組成是非常復(fù)雜的，它不僅取決于微生物的類型，而且還取決于細胞的年齡和生長生理學。第6頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1．細菌細菌的細胞壁經(jīng)酸性水解后，可得到如下產(chǎn)物：(1)肽聚糖肽聚糖是細胞的主要成分，由下列化學物質(zhì)組成：①N-乙酰葡萄糖胺（NAG）；②N-乙酰胞壁酸（NAM）；③半乳糖胺(僅在某些細菌中)。(2)氨基酸(3)磷壁質(zhì)僅在革蘭氏陽性菌中存在。(4)糖(5)脂質(zhì)脂質(zhì)主要存在于革蘭氏陰性菌中。第7頁,共78頁，2024年2月25日，星期天在革蘭氏陽性細菌中，細胞壁的主要成分是肽聚糖，在壁中呈厚度為20～80nm的均相層。第8頁,共78頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏陰性細菌的細胞壁較薄(10～25nm)，但更加復(fù)雜，包括細胞質(zhì)膜在內(nèi)共有三層：一個剛性的肽聚糖內(nèi)層和一個雙層(中間是脂蛋白，外層是脂多糖)。第9頁,共78頁，2024年2月25日，星期天2．真菌和酵母酵母和真菌的細胞壁，在電子顯微鏡下觀察呈纖絲狀，約60nm厚，細胞壁的厚度取決于生長條件特別是碳源的類別。第10頁,共78頁，2024年2月25日，星期天細胞壁水解后的產(chǎn)物：①糖及其氨基衍生物(主要是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖胺)葡聚糖是酵母細胞壁的主要成分(約30％)；甘露糖(約30％)也是重要的成分；幾丁質(zhì)雖然量較少(約1％～2％)，但是幾乎在所有的酵母細胞中都存在。②氨基酸主要是谷氨酸和天門冬氨酸，存在于蛋白質(zhì)中，占細胞壁成分的5％～7％。③脂質(zhì)占細胞壁成分的1％～13.5％，其含量取決于菌種類型、培養(yǎng)基組成及其他一些因素。第11頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.2細胞破碎的方法破碎細胞的方法很多，但選擇何種方法則取決于破碎的目的和待破碎生物體的類型。第13頁,共78頁，2024年2月25日，星期天

依據(jù)細胞的破碎是否外加作用力可分為機械法與非機械法兩大類：第14頁,共78頁，2024年2月25日，星期天機械法中高壓勻漿器和珠磨機不僅在實驗室而且在工業(yè)上得到應(yīng)用，超聲波法和非機械法大多處在實驗室應(yīng)用階段。激光破碎法高速相向流撞擊法冷凍-噴射法新的破碎方法第15頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.2.1機械方法為了破碎微生物細胞，常常選擇機械的方法，因為它們的處理量大，破碎速度較快。采用機械方法，在大多數(shù)情況下要采取冷卻措施，以便除去由于消耗機械能而產(chǎn)生的過多熱量，防止生化物質(zhì)破壞。第16頁,共78頁，2024年2月25日，星期天一．固體剪切方法(珠磨法Beadmill)將細胞在珠磨機中破碎被認為是最有效的一種細胞物理破碎法。第17頁,共78頁，2024年2月25日，星期天進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑<1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。珠磨機的工作原理第18頁,共78頁，2024年2月25日，星期天破碎作用符合一級反應(yīng)動力學，破碎的程度常用細胞破碎率(％)來表示：對于間歇操作：ln[1/(1-R)]=Kt（3-1）對于連續(xù)操作：1n[1/(1-R)]=Kτ（3-2）其中τ=V/qv式中R-破碎率(％)；K-反應(yīng)速率常數(shù)(1/s)；

t-破碎時間(s)；τ-平均停留時間(s)；

V-破碎室懸浮液體積(L)；qv-進料速率(L/s)。第19頁,共78頁，2024年2月25日，星期天反應(yīng)速率常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如珠體直徑、珠體的裝量、細胞濃度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型、操作溫度等等。這些參數(shù)不僅影響破碎程度，也影響破碎所需的能量。第20頁,共78頁，2024年2月25日，星期天影響破碎率的因素：珠體的大小珠體的裝量攪拌轉(zhuǎn)速操作溫度延長研磨時間、增加珠體裝量、提高攪拌轉(zhuǎn)速和操作溫度等可有效提高細胞破碎率，但能耗將大大增加。第21頁,共78頁，2024年2月25日，星期天二．高壓勻漿法

(High-pressurehomogenization)高壓勻漿法是大規(guī)模細胞破碎的常用方法，所用設(shè)備是高壓勻漿器，它由高壓泵和勻漿閥組成。第22頁,共78頁，2024年2月25日，星期天在高壓勻漿器中，高壓室的壓力高達幾十個MPa，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度可達幾百米。這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。高壓勻漿法的原理是利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破裂。第23頁,共78頁，2024年2月25日，星期天在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的或高濃度的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。第24頁,共78頁，2024年2月25日，星期天破碎的動力學方程可表示為：

1n[1/(1-R)]=Ktnpα(3-3)式中R-細胞破碎率；

Kt-與溫度等有關(guān)的破碎常數(shù)；

n-懸浮液通過勻漿器的次數(shù)；

p-操作壓力；

α-與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。第25頁,共78頁，2024年2月25日，星期天由破碎的動力學方程可知，影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)。一般說來，增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎率，但當壓力增大到一定程度后對勻漿器的磨損較大。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55~70MPa。第26頁,共78頁，2024年2月25日，星期天細胞破碎的主要阻力來自于細胞壁，不同種類的微生物細胞及同種細胞在不同的環(huán)境下，其細胞壁的結(jié)構(gòu)不同。一般說來，酵母菌較細菌難破碎，處于靜止狀態(tài)的細胞較處于快速生長狀態(tài)的細胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細胞比在簡單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細胞較難破碎。第27頁,共78頁，2024年2月25日，星期天不宜采用高壓勻漿法破碎的微生物細胞易造成堵塞的團狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包涵體的基因工程菌（包涵體質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥）第28頁,共78頁，2024年2月25日，星期天高壓勻漿法與珠磨法的比較1）高壓勻漿法操作參數(shù)少，易于確定，適合于大規(guī)模操作；珠磨法操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗估計。珠磨機連續(xù)操作時兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性，而高壓勻漿需配備換熱器進行級間冷卻；第29頁,共78頁，2024年2月25日，星期天高壓勻漿法與珠磨法的比較2）珠磨法破碎在適當條件下一次操作即可達到較高的破碎率，而高壓勻漿往往需循環(huán)2～4次才行；3）珠磨機適合于各種微生物細胞的破碎，而高壓勻漿不適合于絲狀真菌及含有包涵體的基因工程菌。第30頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三．超聲破碎法(Ultrasonication)超聲破碎也是應(yīng)用較多的一種細胞破碎法，通常采用的超聲破碎機的工作頻率為15~25kHz。第31頁,共78頁，2024年2月25日，星期天超聲破碎機理---超聲波引起空穴現(xiàn)象在相當高的輸入聲能下，液體各個成核部位會形成許多小氣泡。在聲波膨脹相中，這些氣泡會增大，而在壓縮相中氣泡會被壓縮，直到不能再壓縮時，氣泡破裂，釋放出猛烈的震波。于是，大量聲能被轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機械能，引起局部的剪切梯度使細胞破碎。第32頁,共78頁，2024年2月25日，星期天在用于細胞破碎的容器中，流體動力學按照完全混合方式，則蛋白質(zhì)釋放動力學遵循一級反應(yīng)定律：

1–x=exp（-kt）(3-4)式中x為釋放蛋白質(zhì)的分率；

k為蛋白質(zhì)釋放常數(shù)，min-1；

t為超聲波發(fā)射時間，min。第33頁,共78頁，2024年2月25日，星期天超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。對不同菌種的發(fā)酵液，超聲破碎的效果差別較大。一般地，桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細菌細胞比革蘭氏陽性細菌細胞較易破碎，對酵母菌的效果較差。第34頁,共78頁，2024年2月25日，星期天采用超聲破碎法處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，因而在實驗室規(guī)模應(yīng)用較為普遍。超聲破碎法的優(yōu)點第35頁,共78頁，2024年2月25日，星期天超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時常在細胞懸浮液中加入冰塊或在夾套中通入冷卻劑進行冷卻。但在大規(guī)模操作中，聲能傳遞和散熱均比較困難。此外，超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)失活，因而有一定的局限性。超聲破碎法的缺點第36頁,共78頁，2024年2月25日，星期天四．X-press法X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，具有適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點，但該法不適用于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。第37頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.2.2非機械法許多非機械方法都適用于微生物細胞的破碎，包括酶解、滲透壓沖擊、凍結(jié)和融化、熱處理、化學法溶胞等，其中有些方法的應(yīng)用是有限制的。第38頁,共78頁，2024年2月25日，星期天一．酶溶法(Enzymaticlysis)酶溶法是利用酶反應(yīng)分解破壞細胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的。酶溶法可分為外加酶法和自溶法兩種。第39頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1．外加酶法常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等，而細胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物。第40頁,共78頁，2024年2月25日，星期天利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時必須根據(jù)細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學組成選擇適當?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的次序。實例：

對酵母細胞采用酶溶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)物質(zhì)。

第41頁,共78頁，2024年2月25日，星期天外加酶法主要用于實驗室規(guī)模，如利用酶溶法可從細胞內(nèi)不同位置選擇性地釋放目的產(chǎn)物和制取特殊的胞壁葡聚糖聚合物等。此外，酶溶法大量用來剝離細胞壁，將原生質(zhì)體進行融合，這是細胞工程常用的方法。第42頁,共78頁，2024年2月25日，星期天選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。酶溶法的優(yōu)點第43頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1）溶酶價格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用；2）酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件；3）產(chǎn)物抑制的存在，在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶，這是導(dǎo)致酶溶法胞內(nèi)物質(zhì)釋放低的一個重要因素。酶溶法的不足第44頁,共78頁，2024年2月25日，星期天2．自溶法自溶法是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的?？刂埔欢l件，可以誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。第45頁,共78頁，2024年2月25日，星期天影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH、激活劑等。微生物細胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。實例：

對谷氨酸生產(chǎn)菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3，配成pHl0的緩沖液，再配3％的細胞懸浮液，加熱至70℃，保溫攪拌20min，菌體即自溶。

第46頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1）對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性；2）自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速率下降。自溶法的缺點第47頁,共78頁，2024年2月25日，星期天二．化學滲透法(Chemicalpermeation)某些化學試劑，如有機溶劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性(滲透性)，從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來，這種處理方式稱為化學滲透法。第48頁,共78頁，2024年2月25日，星期天1.

表面活性物質(zhì)表面活性劑可促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞的破碎。TritonX-100是一種非離子型表面活性劑，能結(jié)合并溶解磷脂，因此其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。第49頁,共78頁，2024年2月25日，星期天2.EDTA螯合劑EDTA螯合劑對革蘭氏陰性菌細胞外層膜有破壞作用。革蘭氏陰性菌的外層膜結(jié)構(gòu)通常靠二價陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴，細胞通透性增強。第50頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.有機溶劑能分解細胞壁中的類脂。把相當于細胞量10％的甲苯加到細胞懸浮液中，由于甲苯被吸收進細胞壁的類脂中，使胞壁膜溶脹，進而使細胞破碎，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。除甲苯外，苯對類脂的分解作用也十分強，但由于較易揮發(fā)和較大的毒性而很少應(yīng)用。第51頁,共78頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)各種試劑的不同作用機理，將幾種試劑合理地搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。第52頁,共78頁，2024年2月25日，星期天化學滲透法的優(yōu)點對產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。控制條件可以有選擇地釋放出位于細胞內(nèi)不同部位的產(chǎn)物。細胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。第53頁,共78頁，2024年2月25日，星期天通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細胞。時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50％。有些化學試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中，需設(shè)法分離除去?；瘜W滲透法的缺點第54頁,共78頁，2024年2月25日，星期天三．滲透壓法(Osmoticpressure)

滲透壓法將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中，達平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞溶脹，甚至破碎。于是，細胞內(nèi)容物就釋放出來。第55頁,共78頁，2024年2月25日，星期天細胞壁較脆弱的細胞細胞壁預(yù)先用酶處理在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑(如抗生素等)，使細胞壁有缺陷滲透壓法適用范圍第56頁,共78頁，2024年2月25日，星期天四．反復(fù)凍結(jié)-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。第57頁,共78頁，2024年2月25日，星期天反復(fù)凍結(jié)-融化法只適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復(fù)多次。此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。第58頁,共78頁，2024年2月25日，星期天五．干燥法常用的使細胞干燥的方法有：氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。通過干燥使細胞壁膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就被抽提出來。第59頁,共78頁，2024年2月25日，星期天氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25~30℃下的氣流中吹干，然后用緩沖液抽提。

真空干燥多用于細菌。

冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，將冷凍干燥后的菌體在冷凍條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。第60頁,共78頁，2024年2月25日，星期天干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)變性。提取不穩(wěn)定生化物質(zhì)時，常加某些試劑進行保護，如半胱氨酸、巰基乙醇和亞硫酸鈉等還原劑。第61頁,共78頁，2024年2月25日，星期天第62頁,共78頁，2024年2月25日，星期天若提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，需用機械破碎法；若在細胞膜附近則可用較溫和的非機械法；若提取的產(chǎn)物與細胞膜或壁相結(jié)合時，可采用機械法和化學法相結(jié)合的方法，以促進產(chǎn)物溶解度的提高或緩和操作條件，但保持產(chǎn)物的釋放率不變。選擇破碎方法的一般原則第63頁,共78頁，2024年2月25日，星期天細胞破碎方法的研究方向①多種破碎方法相結(jié)合；②與下游過程相結(jié)合，必須從后分離過程的整體來考慮破碎操作，即破碎過程要易于細胞碎片的除凈；③與上游過程相結(jié)合，細胞的培養(yǎng)過程及其環(huán)境條件對細胞的結(jié)構(gòu)及破碎難易有很大影響。第64頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.3破碎率的評價

破碎率定義為被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：

Y(％)＝[(N0-N)/N0]×100

N0：原始細胞數(shù)量

N：經(jīng)t時間操作后保留下來的未損害完整細胞數(shù)量。第65頁,共78頁，2024年2月25日，星期天

直接計數(shù)法直接對適當稀釋后的樣品進行計數(shù)，可以通過平板計數(shù)技術(shù)或在血球細胞器上用顯微鏡觀察來實現(xiàn)最終染色細胞的計數(shù)。第66頁,共78頁，2024年2月25日，星期天(2)間接計數(shù)法間接計數(shù)法是在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量(可溶性蛋白、酶等)。破碎率可通過被釋放出來化合物的量R與所有細胞的理論最大釋放量Rm之比進行計算。間接計數(shù)法最常用的細胞內(nèi)含物是蛋白質(zhì)，特別是酶活性釋放到基質(zhì)中，是破碎程度很好的指示參數(shù)。第67頁,共78頁，2024年2月25日，星期天3.4包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性很多利用大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白細胞介素-6、人γ-干擾素等）不僅不能分泌到細胞外，而且在細胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒——包涵體。第68頁,共78頁，2024年2月25日，星期天包涵體顆粒直徑約0.1～3.0μm，隨表達產(chǎn)物而異。較大的包涵體可在相差顯微鏡下觀察到，呈現(xiàn)深色的點，所以包涵體又稱光折射體。包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是基因表達產(chǎn)物。這些基因表達產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。第69頁,共78頁，2024