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一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的dna片段及相關(guān)啟動子與應用的制作方法一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的dna片段及相關(guān)啟動子與應用的制作方法本發(fā)明公開了一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的DNA片段及相關(guān)啟動子與應用。本發(fā)明提供了一種DNA分子,其核酸序列為序列表中序列1自5’末端第143-200位核苷酸。含有上述DNA分子的DNA片段也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的實驗證明,本發(fā)明通過改造大腸桿菌lac啟動子-35區(qū)和-10區(qū),得到一個新的啟動子,該啟動子可在尿酸調(diào)控蛋白HucR和尿酸轉(zhuǎn)運蛋白YgfU的配合下,利用尿酸誘導目的蛋白的表達。因此本發(fā)明的啟動子及相關(guān)表達系統(tǒng)可用來在尿酸的誘導下進行目的蛋白表達,也可用于生物型尿酸檢測系統(tǒng)。【專利說明】一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的DNA片段及相關(guān)啟動子與應用【技術(shù)領域】[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領域】,尤其涉及一種用于尿酸誘導目的蛋白表達的DNA片段及相關(guān)啟動子與應用?!颈尘凹夹g(shù)】[0002]重組蛋白表達系統(tǒng)是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要研究內(nèi)容,已在食品、制藥、洗滌劑生產(chǎn)等領域廣泛應用。其中,細菌異源表達系統(tǒng)具有細菌生長代時短、菌體生長密度高、底物廉價、遺傳背景清楚、適合進行工程菌株改造等顯著優(yōu)勢,尤其是大腸桿菌表達系統(tǒng),已成為應用最為廣泛的表達系統(tǒng)之一。[0003]異源蛋白的重組表達,通常要求通過分子克隆等技術(shù)將目標蛋白編碼序列置于具有較強轉(zhuǎn)錄能力啟動子之后。目前,已有多種大腸桿菌適用的啟動子被研究報道。其中直接或間接受異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷調(diào)控的lac、tac、trc、T7啟動子,受四環(huán)素調(diào)控的tet啟動子,受阿拉伯糖調(diào)控的阿拉伯糖啟動子(P_),受鼠李糖調(diào)控的rhaPbad等已被應用,成功表達了多種不同類型的異源重組蛋白。[0004]大腸桿菌的乳糖操縱子已被深入研究。乳糖啟動子Iac本身轉(zhuǎn)錄能力較弱,不適用于重組蛋白的大量表達。但許多啟動子的構(gòu)建,都是在乳糖操縱系統(tǒng)的功能元件上改造而成。例如,經(jīng)典的tac啟動子和trc啟動子均由色氨酸啟動子的-35區(qū)和Iac啟動子的-10區(qū)組合拼接而成,較之Iac啟動子具有更高的表達效率。而T7啟動子則利用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷來調(diào)控T7RNA聚合酶的表達,進而開啟Τ7啟動子系統(tǒng)表達下游重組蛋白;這一技術(shù)已被Novagen等公司研發(fā)出系列商業(yè)化載體,成功表達了多種不同來源的異源蛋白。[0005]總結(jié)一下,一套成功的重組蛋白表達系統(tǒng),首先要求啟動子的相關(guān)元件能被宿主菌識別。而要成功表達異源重組蛋白,不僅要求啟動子具有較高的轉(zhuǎn)錄效率,還要求啟動子滲漏性表達水平較低,尤其是一些對宿主細胞具有一定毒性的蛋白。最后,從降低生產(chǎn)成本考慮,誘導物本身價格應較為低廉,來源廣泛,且不被宿主菌本身代謝系統(tǒng)所降解利用。[0006]具強耐福射特性的極端微生物耐福射球菌(Deinococcusrad1durans)的基因組分析揭示了該菌抗逆特性相關(guān)的部分功能組件。其中,編碼區(qū)drll59編碼的推測尿酸酶調(diào)控蛋白(hypotheticaluricaseregulator,HucR)的研究顯不,HucR可形成蛋白二聚體結(jié)合于其自身編碼序列和反向的尿酸酶編碼序列的啟動子區(qū)域(hucO)中的DNA結(jié)合位點序列;但與尿酸結(jié)合后,HucR蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從DNA結(jié)合位點解離;因此,HucR調(diào)控系統(tǒng)成為耐輻射球菌根據(jù)環(huán)境尿酸情況變化,有效調(diào)控HucR蛋白本身及尿酸降解相關(guān)的尿酸酶表達的系統(tǒng)。因為尿酸是一種價格較低廉的化合物,并且不為大腸桿菌所代謝利用,此研究結(jié)果預示著可對此啟動子加以改造,構(gòu)建以尿酸為誘導物的大腸桿菌重組蛋白表達系統(tǒng)?!景l(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的一個目的是提供一種DNA分子。[0008]本發(fā)明提供的DNA分子,其核酸序列為序列表中序列I自5’末端第143-200位核苷酸。[0009]上述DNA分子作為啟動子中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。[0010]含有上述DNA分子的DNA片段也是本發(fā)明保護的范圍。[0011]上述DNA片段由DNA片段1、目的蛋白基因和含有上述DNA分子的DNA片段2組成;[0012]所述DNA片段I為含有驅(qū)動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的片段;[0013]上述DNA分子用于驅(qū)動所述目的蛋白基因表達。[0014]上述HucR編碼基因和YgfU編碼基因的轉(zhuǎn)錄方向與目的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。[0015]在上述DNA片段中,所述驅(qū)動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6的編碼序列為序列I自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列;[0016]所述HucR編碼基因的編碼序列為序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列;[0017]所述YgfU編碼基因的編碼序列為序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列;[0018]所述DNA片段I具體為序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子;[0019]所述DNA片段2具體為序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0020]上述DNA片段中,所述目的蛋白基因為紅色熒光蛋白基因,所述紅色熒光蛋白基因的編碼序列為序列表中序列I自5’末端280-957位核苷酸;[0021]所述DNA片段為序列I自5’末端第143-3303核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0022]含有上述的DNA分子或含有上述DNA片段的重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。[0023]上述重組載體的核苷酸序列為序列表中的序列I;[0024]上述重組菌為將所述重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌。在本發(fā)明的實施例中,上述宿主菌具體為大腸桿菌DH10B。[0025]上述的DNA分子或上述DNA片段或上述重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在尿酸誘導目的蛋白的表達中的應用。[0026]本發(fā)明的另一個目的是提供一種尿酸誘導目的蛋白的表達的方法。[0027]本發(fā)明提供的方法,包括如下步驟:將目的蛋白的編碼基因通過上述重組載體導入宿主菌中,得到重組菌;再在含有尿酸的培養(yǎng)基中發(fā)酵上述的重組菌,實現(xiàn)尿酸誘導目的蛋白。[0028]上述的DNA分子或上述DNA片段或上述的重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在利用目的蛋白表達水平監(jiān)測尿酸濃度中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。[0029]本發(fā)明的實驗證明,本發(fā)明通過改造大腸桿菌Iac啟動子-35區(qū)和-10區(qū),得到一個新的啟動子,該啟動子可在尿酸調(diào)控蛋白HucR和尿酸轉(zhuǎn)運蛋白YgfU的配合下,利用尿酸誘導目的蛋白的表達。因此本發(fā)明的啟動子及相關(guān)表達系統(tǒng)可用來在尿酸的誘導下進行目的蛋白表達。本發(fā)明也可用于尿酸生物型檢測系統(tǒng)。【專利附圖】【附圖說明】[0030]圖1為SHY質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖[0031]圖2為尿酸誘導系統(tǒng)誘導曲線【具體實施方式】[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。[0034]實施例1、啟動子A及用于尿酸誘導的DNA片段的獲得[0035]下述實施例中的序列I所示的DNA為質(zhì)粒SHY,序列2所示的DNA為對照質(zhì)粒HY,SHY質(zhì)粒的核苷酸序列序列I與對照質(zhì)粒HY核苷酸序列序列2的唯一區(qū)別僅在于將序列2的自5’末端第143-200位核苷酸的Iac啟動子替換為序列表中序列I的自5’末端第143-200位核苷酸所示的啟動子A。[0036]上述質(zhì)粒具體構(gòu)建方法如下:[0037]1、尿酸調(diào)控蛋白HucR及其編碼基因的獲得[0038]提取耐福射球菌(Deinococcusrad1durans)(ATCC13939)的基因組DNA并以其為模板,以5,-gcacatatgatgagcgcgcgcatggataac-3>(forward)和5,-agagagctcttaaacaccctgttcgaggc-3’(reverse)為引物進行PCR擴增。PCR擴增條件如下:先95°C預變性4min,然后95°C45s,55°C30s,72°C30s,共30個循環(huán);最后72°C延伸lOmin。[0039]回收上述PCR反應產(chǎn)物,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得543bp的條帶(經(jīng)過測序,其編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)。[0040]將上述獲得543bp的PCR產(chǎn)物用NdeI和SacI雙酶切,酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的331Ibp的DsRed載體(Clontech公司,產(chǎn)品編號632412)載體骨架用T4連接酶(購自寶生物公司)16°C連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞,獲得重組菌。[0041]提取重組菌的質(zhì)粒,該質(zhì)粒為將序列表中序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列所示的調(diào)控蛋白HucR基因插入DsRed載體(已有組成型啟動子CP6,在該啟動子后插入調(diào)控蛋白HucR基因)的NdeI和SacI酶切位點間得到的載體,測序驗證無誤,命名為SH質(zhì)粒,該質(zhì)粒包括驅(qū)動HucR編碼基因表達的啟動子CP6(其編碼序列為序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列)、HucR編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)。[0042]序列表中序列I自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列所示片段為尿酸調(diào)控蛋白HucR的編碼基因,編碼的尿酸調(diào)控蛋白HucR的氣基酸序列為序列表中序列3。[0043]2、尿酸轉(zhuǎn)運蛋白YgfU及其編碼基因和對照質(zhì)粒HY的獲得[0044]提取大腸桿菌MC1061(Casadaban,MJ&Cohen,SN(1980)AnalysisofgenecontrolsignalsbyDNAfus1nandcloninginEscherichiacol1.J.Mol.B1l.138179-207;公眾可從中國科學院微生物研究所獲得)的基因組DNA并以其為模板,以5’_ttcgagctcaacaccctgttcgaggcccgc_3,(forward)#口5,_gctgaagaaaaatgagcatggagaataagctagccca-3’(reverse)為引物進行PCR擴增。PCR擴增條件如下:先95°C預變性4min,然后95°C45s,55°C30s,72°Clmin30s,共30個循環(huán);最后72°C延伸lOmin。[0045]回收上述PCR反應產(chǎn)物,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得1449bp的條帶(為序列表中序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列所示的轉(zhuǎn)運蛋白YgfU編碼基因)。[0046]將上述獲得的1449bp大小的PCR產(chǎn)物用NheI和SacI雙酶切,酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的3941bp的SH載體骨架用T4連接酶(購自寶生物公司)16°C連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞,獲得重組菌。[0047]提取重組菌的質(zhì)粒,該質(zhì)粒為將序列表中序列I自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列所示的轉(zhuǎn)運蛋白YgfU編碼基因插入SH載體的SacI酶和NheI切位點間得到的載體,測序驗證無誤,命名為HY質(zhì)粒(ygfU基因緊跟hucR基因,也利用CP6啟動子進行表達。[0048]HY質(zhì)粒包括對照DNA片段,對照DNA片段包括驅(qū)動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6(其編碼序列為序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列)、HucR編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)、YgfU編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列)、紅色熒光蛋白RFP基因(其編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957)、驅(qū)動紅色熒光蛋白RFP基因表達的乳糖啟動子Iac(其編碼序列為序列2自5’末端第143-200位核苷酸)。[0049]對照DNA片段由含有驅(qū)動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的DNA片段1、紅色熒光蛋白RFP基因和含有驅(qū)動紅色熒光蛋白RFP基因表達的乳糖啟動子Iac的DNA片段2組成;其中,DNA片段I為序列表中序列2自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子,紅色熒光蛋白RFP基因編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957,DNA片段2為序列表中序列2自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0050]HY質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中的序列2,其中對照DNA片段為序列表中序列2自5’末端第143-3303核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0051]序列表中序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列所示的片段為尿酸轉(zhuǎn)運蛋白YgfU的編碼基因,編碼的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白YgfU的氨基酸序列為序列表中序列4。[0052]3、驅(qū)動目的基因(紅色熒光蛋白基因)表達的啟動子A、用于尿酸誘導的DNA片段及重組載體SHY的獲得[0053]耐輻射球菌基因組中,尿酸調(diào)控蛋白HucR在hucO中的DNA結(jié)合序列已被實驗證實。為了改造HY質(zhì)粒中的啟動子Iac的-35區(qū)和_10區(qū),在設計如下引物時加入新的片段,得到新的啟動子。[0054]I^l5,-atctaagtatat£ttgtgtggaaccgatttaataaaacaa-3>(forward)#口5,—gtctacctatgtaaagcctggggtgcctaatg-3’(reverse)為引物、上述2得到的HY質(zhì)粒為模板進行PCR擴增,將HY質(zhì)粒線性化。PCR擴增條件如下:先95°C預變性4min,然后95°C45s,55°C30s,72°C6min,共30個循環(huán);最后72°C延伸1min00[0055]回收上述PCR反應產(chǎn)物,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得5404bp的條帶。[0056]將上述5404bp線性化質(zhì)粒片段用T4連接酶(購自寶生物公司)16°C連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞,獲得重組菌。[0057]提取重組菌的質(zhì)粒,該質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中的序列1,命名為SHY質(zhì)粒,為重組載體(其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示,其中受尿酸調(diào)控的啟動子為驅(qū)動目的蛋白基因表達的啟動子A)。[0058]SHY質(zhì)粒中的含有用于尿酸誘導的DNA片段,用于尿酸誘導的DNA片段包括驅(qū)動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6(其編碼序列為序列I或2自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補序列)、HucR編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補序列)、YgfU編碼基因(其編碼序列為序列I或2自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補序列)、紅色熒光RFP蛋白基因(其編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957)、驅(qū)動紅色熒光蛋白RFP基因表達的啟動子A(其編碼序列為序列I自5’末端第143-200位核苷酸)。[0059]用于尿酸誘導的DNA片段由含有驅(qū)動HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達的啟動子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的DNA片段1、紅色熒光蛋白RFP基因和含有驅(qū)動紅色熒光蛋白RFP基因表達的啟動子A的DNA片段2組成;其中,DNA片段I為序列表中序列I自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子,紅色熒光蛋白RFP基因編碼序列為序列表中序列I或2自5’末端第280-957,DNA片段2為序列表中序列I自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。[0060]用于尿酸誘導的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第143-3303核苷酸所示的雙鏈DNA分子(即包括改造后受尿酸調(diào)控啟動子、報告基因、受組成型啟動子調(diào)控表達的調(diào)控蛋白HucR和轉(zhuǎn)運蛋白YgfU)。[0061]SHY質(zhì)粒的核苷酸序列序列I與對照質(zhì)粒HY核苷酸序列序列2的唯一區(qū)別僅在于將序列2的自5’末端第143-200位核苷酸所示的啟動子Iac替換為序列表中序列I的自5’末端第143-200位核苷酸所示的啟動子A。[0062]實施例2、啟動子A及用于尿酸誘導的DNA片段的在尿酸誘導目的基因表達中的應用[0063]將由實施例1得到的重組載體SHY和對照質(zhì)粒HY分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHlOB中,得到含有SHY的重組菌DH10B/SHY和含有HY的重組菌DH10B/HY(分別提取質(zhì)粒測序驗證正確)。[0064]挑取重組菌DH10B/SHY和重組菌DH10B/HY的單菌落,在加入氨芐抗生素抗性的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,酵母提取物5g/L,添加抗生素氨芐霉素至100μg/mL)37°C搖床培養(yǎng)過夜(12h)至菌濃度達到飽和(0D600為3.5),得到種子液;[0065]將種子液按照接種量1%接入不同濃度的尿酸培養(yǎng)基中誘導12h,培養(yǎng)條件為37°C搖床(250rpm)。至誘導時間結(jié)束,取出培養(yǎng)物,離心收集菌體棄上清液(3000g,lOmin);再以磷酸緩沖液(lOOmM,pH6.0)重懸菌體,吸取200μL菌體以酶標儀測試菌濃度0D_及紅色熒光蛋白讀數(shù)。[0066]上述不同濃度的尿酸培養(yǎng)基按照如下方法制備:將胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物、氨芐霉素、尿酸與PH7.0、濃度為500mM的3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液母液和水混合,其中胰蛋白胨的終濃度為10g/L、NaCl的終濃度為10g/L、酵母提取物的終濃度為5g/L、氨芐霉素的終濃度為100μg/mL、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液的終濃度為17mM,不同濃度的尿酸培養(yǎng)基中的尿酸終濃度分別為0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.015mM、0.02mM,0.03mM,0.04mM和(λ05mM。[0067]重組菌DH10B/SHY的誘導結(jié)果如圖2所示,縱坐標為報告基因紅色熒光蛋白誘導倍數(shù)(為尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)/不經(jīng)尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)的比值);可以看出,在尿酸終濃度為0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM,0.015mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM和0.05mM中的培養(yǎng)基中,重組菌DH10B/SHY生長并誘導表達蛋白后,報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)分別為168、1539、7506、15726、20247、27946、40416、52698、62883、70139、72818;尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)/不經(jīng)尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)的比值分別為1、9.16,44.67,93.61,120.51,166.34,240.57,313.67、374.30,417.49,433.44倍。測試結(jié)果顯示,隨著尿酸濃度增加,報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)增加。說明啟動子A、含有啟動子A的用于尿酸誘導的DNA片段、SHY載體可以在尿酸的誘導下使目的蛋白紅色熒光蛋白表達。[0068]重組菌DH10B/HY的誘導結(jié)果如下:在尿酸終濃度為0mM、0.002mM、0.005mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.015mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM和0.05mM中的培養(yǎng)基中,重組菌DH10B/HY生長并誘導表達蛋白后,報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)基本均為80-160;不經(jīng)尿酸誘導(OmM)報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)為153;因此可以看出,尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)/不經(jīng)尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白讀數(shù)的比值基本在I以內(nèi),即不被尿酸誘導。[0069]重組菌DH10B/SHY的誘導結(jié)果顯示,當尿酸濃度低于0.01mM時,尿酸誘導報告基因紅色熒光蛋白誘導倍數(shù)與尿酸濃度呈線性關(guān)系,公式為y=11946x-ll.77(其中y為紅色熒光蛋白誘導倍數(shù),X為尿酸濃度,此標準曲線標準誤差平方可達0.97,線性化良好)。因此,可以采用本發(fā)明的載體、啟動子或片段用于外界尿酸濃度監(jiān)測。[0070]上述結(jié)果可以看出,與對照質(zhì)粒HY相比,SHY質(zhì)??梢愿玫卦谀蛩嵴T導下表達目的蛋白,且SHY質(zhì)粒和對照質(zhì)粒HY唯一的區(qū)別僅在于啟動子的不同,說明SHY質(zhì)粒的啟動子A具有更好地在尿酸誘導下表達目的蛋白的功能?!緳?quán)利要求】1.一種DNA分子,其核酸序列為序列表中序列I自

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