海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程-地方標(biāo)準(zhǔn)

ICS07.080CCSZ0637CodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofmarineIDB37/T4711—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4監(jiān)測程序 5監(jiān)測方案設(shè)計 26樣品采集、保存與運(yùn)輸 26.1采樣地點(diǎn) 26.2采樣數(shù)量及方法 26.3采樣記錄 36.4樣品保存與運(yùn)輸 37樣品檢測 37.1方法原理 37.2DNA提取 37.3DNA質(zhì)量檢測 37.4引物選擇 37.5DNA擴(kuò)增 47.6PCR產(chǎn)物回收、純化與序列測定 48質(zhì)量控制 49數(shù)據(jù)分析 410監(jiān)測報告 4附錄A（資料性）樣品采集記錄 5附錄B（資料性）設(shè)備與試劑 6B.1儀器設(shè)備與耗材 6B.2試劑及其配制 6附錄C（資料性）酚-氯仿法提取DNA 7附錄D（資料性）瓊脂糖凝膠電泳 8附錄E（資料性）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 9附錄F（資料性）檢測記錄 10參考文獻(xiàn) DB37/T4711—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由山東省海洋局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。1DB37/T4711—2024海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程本文件確立了海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測程序，規(guī)定了監(jiān)測方案設(shè)計、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢測、質(zhì)量控制、監(jiān)測報告等技術(shù)要求，描述了數(shù)據(jù)分析方法。本文件適用于海洋動物資源的遺傳多樣性監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1遺傳多樣性geneticdiversity種內(nèi)不同群體之間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和。4監(jiān)測程序海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測程序包括監(jiān)測方案設(shè)計、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢測、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測報告，程序見圖1。2DB37/T4711—2024圖1監(jiān)測程序圖5監(jiān)測方案設(shè)計明確監(jiān)測海域、監(jiān)測周期、監(jiān)測時間、樣品采集、保存和運(yùn)輸、樣品檢測方法、監(jiān)測指標(biāo)、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測報告等。其中，對調(diào)查海域某種野生海洋動物資源的遺傳多樣性監(jiān)測，宜每5年~10年開展1次；對人工增殖物種宜每年開展1次。6樣品采集、保存與運(yùn)輸6.1采樣地點(diǎn)采樣地點(diǎn)可根據(jù)調(diào)查需求選擇：a)現(xiàn)場調(diào)查采樣：按GB/T12763.6規(guī)定執(zhí)行。對海洋底棲動物、潮間帶動物進(jìn)行定點(diǎn)采樣，對移動迅速的底棲動物可設(shè)地籠誘捕。對游泳能力強(qiáng)的魚類、甲殼類等進(jìn)行拖網(wǎng)采樣；b)非現(xiàn)場調(diào)查采樣：從調(diào)查海域捕撈作業(yè)船、漁港或市場直接采集來自目標(biāo)海域的新鮮漁獲物，采樣方法按GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。6.2采樣數(shù)量及方法按形態(tài)學(xué)分類后，每個調(diào)查海域應(yīng)采集同一物種30個以上獨(dú)立個體作為一批樣品；保護(hù)動物和珍稀瀕危動物難以達(dá)到該數(shù)量的，可積累該海域一定時期內(nèi)多次調(diào)查采集的不同個體，以實(shí)際采集到的個體數(shù)為準(zhǔn)。根據(jù)監(jiān)測對象不同，可分別選擇以下采樣方法：a)通常采取海洋動物整體；b)對大型海洋動物實(shí)行部分采樣，取肌肉組織約0.5g；c)對海洋保護(hù)動物、珍稀瀕危生物實(shí)行非致死性采樣：3DB37/T4711—2024.視監(jiān)測生物的具體情況，無菌操作剪取部分魚類鰭條組織約0.1g，或用無菌注射器于尾靜脈處抽取血液約0.5mL；.貝類無菌取小部分外套膜組織；.蟹類用無菌注射器從第3步足基節(jié)關(guān)節(jié)膜處刺入抽取血淋巴0.1mL。6.3采樣記錄采集的每批樣品分別填寫樣品采集記錄，格式參見附錄A。6.4樣品保存與運(yùn)輸整體采樣的個體應(yīng)保持完整；部分采樣的組織應(yīng)每個個體獨(dú)立包裝。采樣后宜立即冷凍保存，不具備冷凍條件的4℃~10℃冷藏，冷藏時間不宜超過24h。樣品運(yùn)輸過程中應(yīng)保證溫度在10℃以下。體積小于1cm3的樣品或組織，可量取加入10倍以上體積的乙醇（95%以上）或商品化的樣品保存溶液浸泡，常溫保存與運(yùn)輸。7樣品檢測7.1方法原理利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對海洋動物線粒體DNA中進(jìn)化速度最快的部分序列，通常采用線粒體控制區(qū)（D-loop）序列，不適用D-loop序列的物種可采用細(xì)胞色素b（cytochromeb，Cytb）、細(xì)胞色素氧化酶I（CytochromeoxidaseI，COI）基因或其他線粒體基因序列，進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，獲得群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)。7.2DNA提取取海洋動物肌肉或鰭條組織約0.1g，液氮冷凍研磨、組織勻漿或剪碎后，用酚-氯仿法或動物組織DNA提取試劑盒提取總DNA；血液樣品用血液DNA提取試劑盒提取總DNA。樣品檢測所用設(shè)備和試劑參見附錄B。酚-氯仿法提取DNA的步驟參見附錄C；用商品化試劑盒提取DNA，操作步驟按說明書進(jìn)行。7.3DNA質(zhì)量檢測提取的DNA用洗脫液或滅菌雙蒸水溶解，取5μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA質(zhì)量，電泳方法參見附錄D，或取適量DNA溶液用核酸定量分析儀測定，A260/A280比值為1.8～2.0，DNA濃度不低于50ng/μL。經(jīng)檢測DNA質(zhì)量良好后，-20℃以下冷凍備用。7.4引物選擇7.4.1引物設(shè)計與合成引物宜引用已公開發(fā)表學(xué)術(shù)論文或研究報告，或在基因數(shù)據(jù)庫中搜索目標(biāo)物種的線粒體DNA序列自行設(shè)計2對～3對，引物宜符合Tm值50℃~60℃、長度18bp～24bp、G+C含量在40%～60%、PCR產(chǎn)物長度400bp～600bp。引物序列通過DNA序列比對工具與目的序列比對驗(yàn)證，檢查校正無誤后合成。7.4.2引物篩選4DB37/T4711—2024用合成的引物對樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。按每對引物的Tm值設(shè)定退火溫度，按7.5.2進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，選擇PCR產(chǎn)物條帶單一、清晰、且長度與預(yù)期一致的引物，作為該物種的遺傳多樣性監(jiān)測引物。7.5DNA擴(kuò)增7.5.1PCR反應(yīng)液配方參見附錄E。7.5.2PCR反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性30s，X℃退火30s（其中X視不同引物的具體Tm值確定），72℃延伸30s～60s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。7.6PCR產(chǎn)物回收、純化與序列測定對所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，選擇單一、清晰、且長度與預(yù)期一致的條帶，回收純化目的片段后測序，或PCR產(chǎn)物直接雙向測序。8質(zhì)量控制每批PCR應(yīng)同時做空白、陰性、陽性對照，模板依次為無菌超純水、近源種總DNA溶液、目標(biāo)物種總DNA溶液。瓊脂糖凝膠電泳時，每排樣品中至少要同時加一個合適的DNA分子量梯度標(biāo)準(zhǔn)品。9數(shù)據(jù)分析對測序結(jié)果進(jìn)行比對、剪切和聚類分析，用最大合成似然法（MaximumCompositeLikelihood，MCL）計算群體間或群體內(nèi)個體間遺傳距離，計算單倍體多樣性（樣本中隨機(jī)抽取到兩個不同單倍型的頻率）、平均核苷酸變異數(shù)（所有個體的核苷酸變異數(shù)之和與個體數(shù)的比值）、核苷酸多樣性（平均核苷酸差異數(shù)與序列長度的比值）等遺傳多樣性數(shù)據(jù)。分析結(jié)果格式參見附錄F。10監(jiān)測報告監(jiān)測報告的內(nèi)容應(yīng)包括前言、項(xiàng)目概況、每種生物的監(jiān)測結(jié)果、與歷史記錄比較變化情況、遺傳多樣性保護(hù)存在的問題及保護(hù)建議等。5DB37/T4711—2024樣品采集記錄海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測采樣記錄見表A.1。表A.1樣品采集記錄表6DB37/T4711—2024（資料性）設(shè)備與試劑B.1儀器設(shè)備與耗材儀器設(shè)備與耗材應(yīng)符合以下要求：a)高壓蒸汽滅菌器；b)電子天平：精度大于等于0.001g；c)高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min；e)PCR儀；f)水平凝膠電泳系統(tǒng)；g)凝膠成像系統(tǒng)；h)核酸定量分析儀；i)無菌離心管：1.5mL、0.2mL；j)無菌移液器吸頭：1000μL、200μL、10μL。B.2試劑及其配制除特別說明外，本文使用試劑均為分析純試劑，配制試劑用水應(yīng)為滅菌雙蒸水或去離子水。所需試劑及配制方法如下：a)蛋白酶K（20mg/mL）；b)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解液：CTAB20g溶于1000mLTE緩沖液（Tris-HCl1mol/L，EDTA0.5mol/L，pH=8.0），高壓滅菌備用；c)乙醇：75%、95%以上；d)Taq酶；e)脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）；f)PCR緩沖液；g)瓊脂糖；h)核酸染料；i)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；j)6×上樣緩沖液；k)Tris飽和酚（pH=8.0）；l)三氯甲烷；m)TBE緩沖液：Tris108g，EDTA-Na27.44g，硼酸55g，加去離子水1000mL。7DB37/T4711—2024（資料性）酚-氯仿法提取DNAC.1在1.5mL塑料離心管中加入研磨或剪碎的樣品組織約100mg，加入CTAB溶液600μL、蛋白酶K溶液（20mg/mL）10μL，混勻后55℃水浴3h或37℃水浴過夜，期間顛倒混勻幾次，至消化液澄清。C.2加入苯酚-氯仿（1:1）溶液500μL，顛倒混勻1min，12000rpm離心5min，吸取上清液500μL至另一支潔凈離心管內(nèi)。C.3重復(fù)B.2操作一次。C.4加入氯仿500μL，顛倒混勻30s，12000rpm離心5min，吸取上清液400μL至另一支潔凈離心管內(nèi)。C.5加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃冷凍過夜。C.612000rpm離心5min，倒掉上清液。C.7加75%乙醇500μL，顛倒清洗，12000rpm離心3min，倒掉上清液。C.8重復(fù)B.7操作一次。C.912000rpm瞬時離心，用200μL移液器小心吸出管底殘留溶液，注意不要吸走管底沉淀。C.10離心管開口放于潔凈的環(huán)境中，自然干燥15min～30min。C.11加入100μL滅菌雙蒸水充分溶解，備用。8DB37/T4711—2024（資料性）瓊脂糖凝膠電泳D.1用1×TBE緩沖液制備1%～1.5%的瓊脂糖凝膠，以1:10000（體積比）加入核酸染料。D.2取5μL需要檢測的DNA，與1μL6×上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣。用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)做參照。D.30.5×TBE緩沖液中，100V～120V恒壓電泳30min左右。D.4凝膠移入凝膠成像系統(tǒng)，254nm紫外光透射下拍照記錄并分析。9DB37/T4711—2024（資料性）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配方見表E.1.表E.1PCR體系配方表MgCl