流式細(xì)胞檢測技術(shù)講座

關(guān)于流式細(xì)胞檢測技術(shù)講座主要內(nèi)容

流式細(xì)胞技術(shù)概念流式細(xì)胞技術(shù)原理流式實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)流式細(xì)胞技術(shù)在臨床&科研上的應(yīng)用第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞技術(shù)概述

流式細(xì)胞技術(shù)的概念流式細(xì)胞技術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的檢測范圍

BD公司流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天什么是FCM？流式細(xì)胞術(shù)：利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析及分選的技術(shù)激光技術(shù)+流體力學(xué)+光電測量技術(shù)+計(jì)算機(jī)技術(shù)+細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)+單克隆抗體技術(shù)第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天FCM的特點(diǎn)測量速度快：最快可在1秒種內(nèi)檢測上萬個(gè)細(xì)胞可進(jìn)行多參數(shù)測量：可以對同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況高分辨率(CV<2%)、高靈敏度(熒光檢測靈敏度≤100MESF，前向角散射光檢測靈敏度(0.2～0.5um)既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)，分選純度可達(dá)99%以上第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天BD公司流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAria第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)光路：

1、激光光源及光束成形系統(tǒng)：

氬離子(488nm)

紅色氦氖激光(633nm)

2、光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔液路——流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)（鞘流原理）信號檢測與分析：光電倍增管(PMT)、補(bǔ)償電路存儲、顯示、分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)細(xì)胞分選系統(tǒng)

第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞技術(shù)原理熒光發(fā)生機(jī)理及熒光光譜濾光片散射光信號的檢測熒光信號的檢測數(shù)據(jù)的儲存與分析第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光及熒光發(fā)生機(jī)理簡介

熒光及熒光素：某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線——即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素?zé)晒獍l(fā)生機(jī)理：室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)”，當(dāng)熒光素在一定波長（激發(fā)波長）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細(xì)胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級躍遷，進(jìn)入新的狀態(tài)，稱為“激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它可以通過在10-9～10-7秒的極短時(shí)間內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜

任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個(gè)特征光譜

激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：

是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max

發(fā)射光譜（Emission，Em）：

是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max

熒光素的使用：

選擇正確的激光器確定所需熒光探測器（PMT）488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天LongpassShortpassBandpass460500540460500540475500525SP500LP500BP500/50光學(xué)系統(tǒng)：濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光光譜示意圖第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天散射光信號FSCSensorLaserSSCSensor第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

反應(yīng)細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

反應(yīng)細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖

（紅細(xì)胞溶解后）第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞儀的熒光檢測信號熒光信號使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE

數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)

二維點(diǎn)圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)

三維圖（3DPlot）等第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)分析直方圖分析第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天點(diǎn)圖分析數(shù)據(jù)分析第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)分析三維圖分析第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則常用熒光標(biāo)記探針常用儀器熒光通道分布實(shí)驗(yàn)對照、同型對照、補(bǔ)償對照熒光與抗體的搭配小結(jié)第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天常用的單克隆抗體熒光標(biāo)記探針488nm激光激發(fā)：FITC（異硫氰酸熒光素）：熒光強(qiáng)度可受pH的影響，當(dāng)pH降低時(shí)其熒光強(qiáng)度也隨之減弱PE（藻紅蛋白）PerCP（多甲藻葉綠素蛋白）：光量子產(chǎn)量并不太高，最好應(yīng)用在檢測表達(dá)較高的抗原上PerCP-Cy5.5（葉綠素蛋白偶聯(lián)物）PE-Cy7（藻紅蛋白偶聯(lián)物）PE-Cy5（藻紅蛋白偶聯(lián)物，又稱Cy-Chrome）PE-TexasRed（藻紅蛋白-德州紅偶聯(lián)物，又稱ECD）633nm激光激發(fā)：APC（別藻青蛋白）APC-Cy7（別藻青蛋白偶聯(lián)物）第27頁,共46頁，2024年2月25日，星期天常用的核酸熒光標(biāo)記探針PI（碘化丙啶）：可嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中，主要用于對DNA染色，使用時(shí)需用RNase對細(xì)胞進(jìn)行處理；不能透過活細(xì)胞膜對核酸染色，可用于鑒別活死細(xì)胞，對活細(xì)胞染色時(shí)需對細(xì)胞膜打孔，以便染料透過。488nm激光激發(fā)，發(fā)射光譜寬泛550～725nm，可與PE共用通道TO（噻唑橙）：可用于對網(wǎng)織紅細(xì)胞中的RNA進(jìn)行檢測定量分析，TO的熒光強(qiáng)度與RNA含量由良好的線性關(guān)系，對細(xì)胞膜的通透性好，可直接對活細(xì)胞染色，488nm激發(fā)，可發(fā)射出530nm熒光，可與FITC共用通道第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天常用熒光素激發(fā)、發(fā)射、光源波長

以及適用機(jī)型第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天FACSCalibur光學(xué)濾片檢測器組（激光器）PMT位置帶通/長通透鏡適用染料488nm藍(lán)色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670LPPerCP,PerCP-Cy5.5PE-Cy7635nm紅色激光FL4661/16APC第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天FACSCanto光學(xué)濾片檢測器組（激光器）PMT位置帶通/長通透鏡適用染料八角形（488nm藍(lán)色激光）A780/60PE-Cy7B670LPPerCP-Cy5.5,PerCPC585/42PE,PID530/30FITC三角形（633nm紅色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天FACSAria光學(xué)濾片檢測器排列（激光器）光電倍增管BP濾光片

可用染料八角形（488nm藍(lán)色激光）A780/60PE-Cy7B695/40PerCP-Cy5.5,PerCPC610/20PE-TexasRedD575/26PEE530/30FITC三角形（633nm紅色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC三角形（407nm紫色激光）A530/30AlexaFluor430B450/40CascadeBlue,PacificBlue,DAPI,Hoechst,AlexaFluor405第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光染色對照陽性對照使用已知陽性樣本，幫助排除試劑的質(zhì)量、濃度、特異性以及染色方法等因素陰性對照空白對照（自發(fā)熒光）自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。一般說來，細(xì)胞成分中能產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)，如腫瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞等；樣本死細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)樣本（自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光）特異熒光，即抗體F(ab’)2段與細(xì)胞抗原特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光非特異熒光，即抗體Fc段與細(xì)胞表面的Fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天同型對照同型對照（IsotypeControl）：與實(shí)驗(yàn)染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色例如，標(biāo)記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標(biāo)記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應(yīng)用相同濃度和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分別標(biāo)記FITC和PE第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光染色補(bǔ)償對照的設(shè)置補(bǔ)償對照（雙色或多色分析時(shí)）熒光補(bǔ)償（compensation）是指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectraloverlap）的過程，即從一個(gè)被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號將單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體分別進(jìn)行單色熒光染色

※幾色分析就需要制備幾個(gè)補(bǔ)償對照管設(shè)置補(bǔ)償?shù)幕静襟E：①上同型對照管，調(diào)節(jié)PMT電壓，使陰性細(xì)胞群體處于雙熒光散點(diǎn)圖的左下角101道以內(nèi)；②分別上單陽補(bǔ)償管，依次調(diào)節(jié)相鄰熒光的補(bǔ)償設(shè)置，直至陽性和陰性細(xì)胞群處于最合適的位置第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天雙色熒光補(bǔ)償?shù)?6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天雙色熒光補(bǔ)償?shù)?7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天雙色熒光補(bǔ)償?shù)?8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天雙色熒光補(bǔ)償?shù)?9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)例分析類型管功能

加入的抗體單色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCP2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCP3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCP4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCP5Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCP四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCPγ1-APC4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCPγ1-APC5Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPD-APC6Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCPD-APCNo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫M(jìn)ouse血清純化而來1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PE3C-PerCP（γ1）γ1-PerCP4D-APC（γ1）γ1-APC第40頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光抗體組合的選擇用不同顏色的熒光素標(biāo)記不同種類的單克隆抗體，可以在一個(gè)細(xì)胞上同時(shí)分析多種抗原分子，但并非各種熒光抗體均可以自由地組合在一起，在確定組合選擇之前，還必須考慮到一些影響因素流式細(xì)胞儀的類型及熒光光譜選擇適當(dāng)強(qiáng)度的光源作為熒光物質(zhì)的激發(fā)光源，并選擇適合于被檢熒光物質(zhì)選擇性吸收的光譜濾光片接收熒光了解不同抗體的細(xì)胞反應(yīng)譜，以及染色模式根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇抗體。因?yàn)橄嗤珻D編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。如CD45RA表達(dá)在幼稚/靜止T淋巴細(xì)胞，而CD45RO表達(dá)在記憶/活化T淋巴細(xì)胞。胞膜和胞內(nèi)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。第41頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光抗體組合的選擇3.抗體結(jié)合熒光素的熒光強(qiáng)度

每一種熒光素的相對熒光強(qiáng)度都不一樣。一個(gè)特定抗體，能否區(qū)分陰性與陽性結(jié)果，即有較好的S/N比值，取決于該抗體用何種熒光素標(biāo)記。熒光素相對強(qiáng)度也與儀器有關(guān)，這是由于不同儀器使用的激光和濾光片組合不同，因此造成了熒光強(qiáng)度的差別。下面列出了一般情況下，不同熒光素的相對強(qiáng)度的大小順序，某些個(gè)別的單克隆抗體的熒光標(biāo)記情況會有所不同。

APC>PE>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCP

4.抗原密度

高表達(dá)的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測，而較低表達(dá)的抗原（如細(xì)胞因子）則需要用較高S/N比值的熒光素（如PE和APC）標(biāo)記的抗體檢測，從而達(dá)到有效區(qū)分陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞的目的。如血小板活化檢測試劑：

PAC-1-FITC/CD62P-PE/CD61-PerCP第42頁,共46頁，2024年2月25日，星期天熒光抗體組合的選擇5.熒光光譜之間的重疊在多色分析中，雖然可以通過熒光補(bǔ)償消除熒光光譜重疊的影響，但使用熒光探針的種類越多，補(bǔ)償?shù)膹?fù)雜程度增加，因此選擇光譜重疊越少的組合越好6.自發(fā)熒光每個(gè)細(xì)胞群體的自發(fā)熒光水平都不同，自發(fā)熒光在高波長范圍里（>600nm）迅速降低。因此檢測自發(fā)熒光水平高的細(xì)胞時(shí)，使用發(fā)射光波長較長的熒光染料（如APC），可得到較好的S/N比7.熒光素濃度、配伍不當(dāng)、試劑的質(zhì)量均導(dǎo)致假陰性/