馬鈴薯癌腫病檢疫鑒定方法

馬鈴薯癌腫病檢疫鑒定方法MethodsofquarantineandidentificationforSynchytriumendo本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B均為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國云南出入境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蔣小龍、沐詠民、寸東義、魏正、白松。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯癌腫病菌的檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯種薯、食用薯以及夾帶土壤中馬鈴薯癌腫病菌的檢疫和鑒定。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。癌腫病的典型癥狀，花椰菜形，產(chǎn)生在塊莖芽眼部位。初期白淺色，后為深褐色。此外，在芽眼部位還可形成“棒狀”、“掌狀”等膨大畸形組織。產(chǎn)生于休眠芽、幼芽表面。單個透明，隆起小泡，大小為0.5mm左右。產(chǎn)生于休眠芽、幼芽及癌腫組織表皮。形似蓮花，其組織切片呈現(xiàn)為大型薄壁細(xì)胞組成的環(huán)狀組織。其中央含夏孢子囊(堆)或休眠孢子囊。在塊莖表面產(chǎn)生不規(guī)則形或環(huán)形(中央凹陷，形似火山口)隆起組織，沿水平擴展。始細(xì)胞protocell被侵染細(xì)胞周圍的毗鄰細(xì)胞呈輻射狀的增生，中心被侵染細(xì)胞內(nèi)的菌體為始細(xì)胞。原孢堆prosoru:由始細(xì)胞逐漸擴大并充滿寄主細(xì)胞而成，有孢壁。產(chǎn)生于原孢堆外壁上方。原孢堆細(xì)胞質(zhì)和孢核通過外壁小孔排到新薄囊泡內(nèi)。夏孢子囊堆summersporangiosorus由薄囊泡發(fā)育而成。呈卵形、扁平或近球形，薄壁，直徑為47μm~72μm×81μm~100μm(有資料報道為40.3μm~77μm×31.4μm~64.4μm)。夏孢子囊summersporangium由夏孢子囊堆的內(nèi)含物發(fā)育成多角形、卵形或近球形。休眠孢子囊restingsporangfum單個產(chǎn)生于癌組織表層細(xì)胞內(nèi)，卵圓形、長圓形或角形。銹褐色，直徑25μm~75μm。璧厚，分三層，其內(nèi)壁薄，無色。中壁光滑，金褐色，壁厚。外壁厚薄不均，有皺紋(不規(guī)則脊突)。成熟休眠孢子囊內(nèi)含數(shù)百個游動孢子。3.1馬鈴薯癌腫病菌的分類地位馬鈴薯癌腫病菌(Synchytriumendobiotium(Schilberszky)Percival,異名S.salaniMassee和ChrysophlyetisendohiotiumSchilber(Synchytrium),內(nèi)生集壺菌(馬鈴薯癌腫病菌),可侵染馬鈴薯薯塊，引起癌腫，英文名Potatowartdisease,簡稱馬鈴薯癌腫病。3.2檢疫原理6現(xiàn)場檢疫6.1直觀檢查重點檢查是否有腐爛、開裂、皰斑、腫塊等病害癥狀和土壤等。最低抽檢10件且不少于1000粒。6.2抽樣隨機抽樣，每份樣品的抽樣點不少于五個。500粒以下取一份；501～2000粒取二份；2001～5000粒取三份：5001～10000粒取四份；10001粒以上每增加10000粒增取一份樣品，不足10000粒的余量計取一份樣品。每份樣品為20粒。6.3土壤的收集通過毛刷或水洗(少量水)方法小心收集塊莖表面土壤，并注意收集包裝內(nèi)外散落的土壤。土壤樣品重量在500g~1000g左右。將土樣風(fēng)干、研細(xì)、分別用105μm、74μm、37μm的樣篩過篩，除去石塊等雜質(zhì)，取底層篩下土壤，待檢。7鑒定特征7.1癥狀主要特征馬鈴薯癌腫病菌可引起癌腫、泡突、蓮花座、瘡癡等典型癥狀。7.2病原主要特征馬鈴薯癌腫病菌以菌體進行繁殖，其特征是菌體內(nèi)生，整個菌體轉(zhuǎn)化為一個或多個繁殖體，根據(jù)不同的發(fā)育階段可觀察到始細(xì)胞、原孢堆、泡囊、夏孢子囊堆、夏孢子囊、休眠孢子囊等病原特征。8試驗室鑒定8.1薯塊檢驗首先將現(xiàn)場抽樣的可疑薯塊，借助體視顯微鏡檢查，觀察是否有癌腫、泡突、蓮花座及各畸形癌腫組織表層內(nèi)是否有夏孢子囊(淺色)或休眠孢子囊(深色);其次再將薯芽及其周圍組織連同表皮作斷面切片，在顯微鏡下檢查有無原孢堆和休眠孢子囊。8.2病組織檢查將肉眼可見的癌變組織置于滅菌水玻片上靜置30min左右，即可見大量游動孢子釋出。用0.1%升汞水一滴殺死固定，在空氣中晾干，再用1%堿性品紅染色，洗去染色液鏡檢，可見單鞭毛的游動孢子和雙鞭毛的結(jié)合子。將6.3制備的土壤樣品用四氯化碳一乳酚油進行萃取，制成土壤懸浮液，即刻取懸浮液制片鏡檢是否有休眠孢子囊(方法見附錄A)。8.4休眠孢子囊的提取將帶菌的土壤采用“清水漂浮法”提取休眠孢子囊，方法是將菌土樣風(fēng)干、研細(xì)、分別用105μm、74μm、37μm的樣篩過篩，除去石塊等雜質(zhì)然后連續(xù)加水，充分?jǐn)嚢?，靜置3min~5min,清液上浮，緩緩移去，體眠孢子囊浮在此清液中。8.5土壤中休眠孢子囊活力測定將8.4提取的休眠孢子囊，用2%酸性品紅熱處理2min~3min,制片鏡檢，活的染色慢且呈淺玫瑰色，死的染色快且深紅色。8.5.2質(zhì)壁分離方法將8.4提取的休眠孢子囊，用無機鹽水溶液如氯化鈉(36g/100mL)或氯化銨(48g/100mL)或硝酸銨(48g/100ml)處理5min~10min,在這些鹽溶液中，活的孢子囊全部呈現(xiàn)質(zhì)壁分離，死的孢子囊則無質(zhì)壁分離現(xiàn)象。8.5.3熒光反應(yīng)法將8.4提取的休眠孢子囊，用吖啶橙染色制片，在熒光顯微鏡藍(lán)色光下觀察休眠孢子囊熒光反應(yīng)?；钚菝哝咦幽覂?nèi)含物清晰，囊壁及內(nèi)含物產(chǎn)生強烈熒光反應(yīng)。死休眠孢子囊內(nèi)含物不清晰，無熒光反應(yīng)，皇暗色(方法見附錄B)。9結(jié)果判定凡同時具備本標(biāo)準(zhǔn)7,1癥狀特征之一和7.2病原特征之一的，可判定為馬鈴薯癌腫病菌。凡符合8.5.1、8.5.2、8.5.3活性特征之一的，可判定為土壤帶有馬鈴薯癌腫病菌的活性休眠孢子囊。10樣品留存經(jīng)鑒定確定為馬鈴薯癌腫病的樣品，將病原菌切片制成永久玻片，病薯或病土密封在塑料袋中4℃保存，以便接受復(fù)核或進行重復(fù)鑒定。(規(guī)范性附錄)四氯化碳一乳酚油漂浮法稱取備好的土樣1.5g～2g倒入試管內(nèi)，加8mL四氯化碳，充分?jǐn)嚢?，靜置2min~3min讓土壤顆粒等雜質(zhì)沉降，休眠孢子懸浮在四氯化碳液中，然后將沉淀后的懸浮液倒入另一個試管中，加入2mL的乳酚油，充分?jǐn)嚢?，使四氯化碳懸浮液與乳酚油混合均勻，然后靜置，乳酚油密度小于四氯化碳密度，逐漸上浮分層，最后完全分層，形成明顯的乳酚油和四氯化碳兩層，休眠孢子囊也隨著漂浮在乳酚油中，成乳酚油休眠孢子囊懸浮液。用移液管定量吸取乳酚油孢子囊懸浮液0.1mL,制片鏡檢。(規(guī)范性附錄)熒光反應(yīng)法操作步驟B.1稱取0.5g待檢土壤，倒入試管內(nèi)，加入10mL.0.1%曲拉通X-1001×10~4“磷酸緩沖液(pH7.4)浸泡6min~10rain,然后充分震蕩搖勻，通過150μm、105μm、37μn網(wǎng)篩濕濾，再先后用1×10~4“磷酸緩沖液和0.85%氯化鈉溶液沖洗37μm篩的篩上物，將經(jīng)過沖洗的篩上物(休眠孢子囊)收集到離心管中，離心5min(2000r/min),移去上清液，留下沉淀物，即休眠孢子囊。然后離心5min(2000r/rain),移去離心管上清液。B.3向離心管中加入2ml～4mL磷酸緩沖液，搖勻，離心，移去上清液，然后再加入10%水合甘油清洗液，搖勻，再離心