外源基因轉移的細胞學方法和分子方法

外源基因轉移的細胞學方法和分子方法首先可以通過引種解決本地區(qū)的蟲害、環(huán)境脅迫造成產(chǎn)量下降的問題。其次選擇抗性好的品種做親本，與農藝性狀較好的親本雜交，選擇農藝性狀和抗性均較好的后代推廣。（品種間雜交，雜種優(yōu)勢利用）遠緣雜交（染色體工程）誘變育種生物技術育種：組織和細胞培養(yǎng)技術，細胞融合技術，外源DNA導入等。小麥抗病蟲育種和抗環(huán)境脅迫育種的主要方法第2頁,共28頁，2024年2月25日，星期天要將野生親緣和潛在于更遠緣物種的異源遺傳物質轉移到栽培小麥中可以用兩種主要方法：細胞遺傳學操縱（染色體工程)

和分子技術（遺傳工程)。外源基因導入小麥的兩種方法第3頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

什么是染色體工程？

植物染色體工程的用途很廣,其中最重要的是基因定位和異源基因的導入。用導入異源基因改良現(xiàn)有小麥品種是小麥育種的重要方向之一。

通過染色體工程有效地轉移外源基因,并創(chuàng)造在育種中可利用的種質材料,大致經(jīng)過以下步驟:種間或屬間雜交→F1或產(chǎn)生雙二倍體→異附加系→異代換系→易位系。其中異附加系、異代換系和易位系統(tǒng)稱為異染色體系,易位系的育種利用價值最高。第4頁,共28頁，2024年2月25日，星期天雙二倍體是染色體工程中的重要基礎材料,在其和小麥的回交后代中可以得到小麥的二體異附加系。二體異附加系是獲得代換系、端體附加系和易位系的基礎,易位系是把帶有目的基因的異源染色體片段整合到小麥染色體上的材料。第5頁,共28頁，2024年2月25日，星期天整條染色體的細胞遺傳學操縱

附加系

細胞中添加異種染色體的系統(tǒng)稱異附加系。培育此添加系統(tǒng)的方法多種多樣,常規(guī)法、橋梁親本法、單倍體法、雙二倍回交法、雙重單體或多重單體附加法等均能創(chuàng)造異附加系。其中,最常用的方法是獲得栽培物種與親緣物種間的雜種F1后,用受體品種與F1或由F1加倍成的雙倍體回交一至數(shù)次,從回交后代中選擇添加單體再經(jīng)自交產(chǎn)生添加二體。第6頁,共28頁，2024年2月25日，星期天普通小麥（AABBDD）

X

簇毛麥（VV）2n=6x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIv F1(ABDV)X普通小麥（AABBDD）

2n=4x=28=21Iw+7Iv2n=6x=42=21IIw

回交，自交

BCnFn

細胞學鑒定

21IIw+1II1v~7v雜交回交法第7頁,共28頁，2024年2月25日，星期天普通小麥（AABBDD）

X

黑麥（RR）

2n=4x=42=21IIw

2n=2x=14=7IIR F1(ABDR)2n=4x=28=21Iw+7IR

不減數(shù)配子染色體加倍 雙二倍體X普通小麥

（AABBDDRR）（AABBDD）

AABBDDRX普通小麥AABBDD

回交，自交

21IIw+1II1R~7RBCnFn

細胞學鑒定雙二倍體回交法第8頁,共28頁，2024年2月25日，星期天圓錐小麥（AABB）

X

簇毛麥（VV）2n=4x=28=14IIw

2n=2x=14=7IIv F1(ABV)2n=3x=31=14Iw+7Iv

不減數(shù)配子染色體加倍 雙二倍體X普通小麥

（AABBVV）（AABBDD）

AABBDVX普通小麥AABBDD

回交，自交

21IIw+1II1v~7vBCnFn

細胞學鑒定橋梁親本法第9頁,共28頁，2024年2月25日，星期天單倍體法單倍體法有兩種，一種是花藥培養(yǎng)法，另一種是染色體消失法。他們通過培養(yǎng)普通小麥與六倍體小黑麥、八倍體小偃麥的雜種Ｆ1花藥，獲得了各種單倍體異附加系，加倍后從中選出了小麥雙體異附加系。

Barclay（1975）報道了小麥分別與球莖大麥和玉米雜交，其后代中外源染色體自然消失的現(xiàn)象，并高頻率地獲得了小麥單倍體。李平路等（1998）首次將小麥×玉米法應用于小麥異附加系的選育中，用煙農15-八倍體小濱麥、煙農15-中間偃麥草的雜種后代分別與玉米雜交，成功地獲得了小麥-濱麥和小麥-中間偃麥草的單倍體異附加株。

第10頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

某種植物的一對染色體被他種植物的一對染色體所代換而形成的新類型稱異代換系。

培育異代換系的方法也有不同幾種,主要是利用單體或缺體與異附加系雜交進行。代換系第11頁,共28頁，2024年2月25日，星期天遠緣雜種連續(xù)回交普通小麥（AABBDD）

X

黑麥（RR）2n=6x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIR F1(ABDR)X普通小麥（AABBDD）

2n=4x=28=21Iw+7IR2n=6x=42=21IIw

回交，自交

BCnFn

細胞學鑒定

AABBDD-1A1A+1R1R……AABBDD-7D7D+7R7R第12頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

單體1AX二體附加系(1R)2n=41=21IIw-1II1A+1I1A2n=44=21IIw+1II1R

F1(2n=42=21IIw-1I1A+1I1R)(2n=43=21IIw+1I1R,2n=42=21IIw-1I1A+1I1R)

選擇2n=42的個體自交

2n=42=21IIw-1II1A+1II1R單體與附加二體雜交第13頁,共28頁，2024年2月25日，星期天缺體4DX小偃麥八倍體2n=41=21IIw-1II4D2n=56=21IIw+7IIE

F1X缺體4D

(2n=48=20IIw+7IE+1I4D)2n=41=21IIw-1II4D

BC1F1細胞學、形態(tài)學篩選

2n=41=21IIw-1I4D+1I4E

自交

2n=42=21IIw-1II4D+1II4E缺體回交法第14頁,共28頁，2024年2月25日，星期天異附加系和異代換系的鑒定1）染色體計數(shù)和染色體構型分析2）染色體分帶：C-帶，N-帶3）生化標記:同工酶，蛋白質4）分子標記:RFLP,RAPD…5）DNA分子原位雜交：GISH，F(xiàn)ISH6）形態(tài)標記第15頁,共28頁，2024年2月25日，星期天易位系通過附加或代換異源染色體可以將有益基因引入栽培植物中,但引入的染色體除攜帶有益基因外,亦帶有不利基因。如能使異源染色體上攜帶的有益基因通過易位整合到栽培植物的染色體上,就可以減少或消除不利基因的作用。這就需要建立易位系。所謂的易位系是指異源染色體與栽培植物染色體之間相互易位的植物。在易位系中,通過染色體易位達到了異源目的基因的轉移,這便是建立易位系的動機所在。第16頁,共28頁，2024年2月25日，星期天遠緣雜交中經(jīng)常有自發(fā)易位產(chǎn)生,但異種、屬間的染色體自然發(fā)生易位的頻率很低。實踐中,易位系的建立就需人工誘發(fā)易位,一般是用電離射線照射或化學誘變劑處理。輻射能使染色體隨機斷裂,斷片常以各種不同方式進行重接,產(chǎn)生各種染色體結構變異,導致易位。小麥易位系的創(chuàng)建方法便是對攜有目標基因的單體異附加系進行輻射處理,以這種基因的表型性狀為標記,在后代中選擇帶有這種基因而染色體數(shù)目仍為2n=42的個體。因為目的基因已轉移到小麥染色體上,這樣的個體就是易位系。第17頁,共28頁，2024年2月25日，星期天易位系的鑒定易位系一般來說不發(fā)生染色體數(shù)目的變化,因而它的鑒定要比鑒定異附加系和異代換系困難得多。常規(guī)的染色體計數(shù)以及染色體帶型分析效果不佳,特別是對不顯帶區(qū)段和小片段易位更是無能為力。目前,一般采用同工酶分析或分子原位雜交技術對易位染色體進行標定。第18頁,共28頁，2024年2月25日，星期天植物外源DNA的導入方法

外源DNA的導入是指通過某種特定的途徑將外源基因或外源DNA片段導入受體細胞，使之整合到受體細胞基因組中，而實現(xiàn)其功能表達的過程。第19頁,共28頁，2024年2月25日，星期天目前已經(jīng)建立了十多種外源DNA導入方法，按照技術屬性可將它們分為物理法、化學法、生物法：1、物理法：基因槍法、電激法、微注射法、激光穿刺法、超聲波法、碳化硅纖維法等；2、化學法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸鈣－DNA共沉淀、脂質體法等；3、生物法：農桿菌介導法、花粉管通道法、浸漬法、病毒介導法等。第20頁,共28頁，2024年2月25日，星期天一、原理農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，它們侵染植物后能誘發(fā)植物形成腫瘤。從一種致癌的農桿菌中分離出了一種巨大質粒（約200Kb），稱為致癌質粒，簡稱Ti質粒。Ti質粒上有一段DNA被稱為轉移DNA（簡稱T－DNA），能轉移并整合到植物染色體上，其上攜帶的基因能在受體細胞中表達。Ti質粒隨后被改造用作人工植物基因工程的載體。這種利用農桿菌的遺傳轉化體系，將外源目的基因或DNA片段插入Ti質粒的T－DNA中，并隨之導入受體植物細胞，而獲得轉基因植株的方法，即為農桿菌介導法。

第一節(jié)

農桿菌介導法第21頁,共28頁，2024年2月25日，星期天Ti質粒的必需組成元件，包括T－DNA區(qū)域和致毒基因(Virgene)TDNA是Ti質粒中唯一能夠與植物染色體整合的序列，而致病區(qū)中的一系列基因則起著輔助整合的作用。與冠癭堿生成有關的是Vir區(qū)和T-DNA區(qū)，植物體內不能合成冠癭堿，冠癭堿的合成為農桿菌的生長提供了必要的碳源和氮源。第22頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法、粒子轟擊法、高速粒子噴射技術、彈道微靶點射擊，是一種借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細胞的轉化技術。第23頁,共28頁，2024年2月25日，星期天原理基因槍技術的基本原理是利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅動力，將載有外源DNA的金（或鎢）粉等金屬微粒加速，射入受體細胞或組織