流式細(xì)胞儀結(jié)果分析

關(guān)于流式細(xì)胞儀結(jié)果分析流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細(xì)胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)第2頁,共71頁，2024年2月25日，星期天流式細(xì)胞術(shù)最大的特點是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細(xì)胞進行定量分析或純化分選。

特點：檢測速度快、檢測通量高、單細(xì)胞多參數(shù)的檢測流式細(xì)胞術(shù)的特點第3頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

流式細(xì)胞儀是測量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強度的細(xì)胞分析儀，是在單個細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。流式流式細(xì)胞儀儀流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀第4頁,共71頁，2024年2月25日，星期天樣本來源：各種細(xì)胞（如外周血，骨髓，實體組織、懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞），微生物，人工合成微球等。檢測大?。阂话闶?.5um～40um流式細(xì)胞儀可以做什么？第5頁,共71頁，2024年2月25日，星期天液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

分析型流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的組成第6頁,共71頁，2024年2月25日，星期天（1）液流液流系統(tǒng)流動室流動室（Flowcell）是液流系統(tǒng)的核心部件，流動室是由石英玻璃制成，單細(xì)胞懸液在流動室里被鞘液流包繞通過流動室內(nèi)一定孔徑的孔，檢測區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交。第7頁,共71頁，2024年2月25日，星期天層流水力聚焦技術(shù)第8頁,共71頁，2024年2月25日，星期天光學(xué)系統(tǒng)—LightscatteringatFSCrepresentstheparticlesizeandarea—LightscatteringatSSCdependsongranularityandcomplexityoftheparticle第9頁,共71頁，2024年2月25日，星期天激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）光學(xué)系統(tǒng)第10頁,共71頁，2024年2月25日，星期天FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學(xué)系統(tǒng)示意圖第11頁,共71頁，2024年2月25日，星期天主要由計算機及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第12頁,共71頁，2024年2月25日，星期天基本工作原理第13頁,共71頁，2024年2月25日，星期天單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程第14頁,共71頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測定第15頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細(xì)胞體積大小成正比。第17頁,共71頁，2024年2月25日，星期天FALSSensorLaser前向散射光示意圖第18頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。第19頁,共71頁，2024年2月25日，星期天FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖第20頁,共71頁，2024年2月25日，星期天 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細(xì)胞進行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第21頁,共71頁，2024年2月25日，星期天熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細(xì)胞上的多個不同特征。線性放大器和對數(shù)放大器三、熒光測量第22頁,共71頁，2024年2月25日，星期天熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)第23頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共71頁，2024年2月25日，星期天熒光補償?shù)?5頁,共71頁，2024年2月25日，星期天通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選主要是在對具有某種特征的細(xì)胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細(xì)胞分選原理第26頁,共71頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電（一）分選基本原理第27頁,共71頁，2024年2月25日，星期天分選速度：單位時間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測量點的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實際得率。與分選速度成反比。（二）分選的技術(shù)要求第28頁,共71頁，2024年2月25日，星期天參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設(shè)門分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析第29頁,共71頁，2024年2月25日，星期天FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)第30頁,共71頁，2024年2月25日，星期天單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式第31頁,共71頁，2024年2月25日，星期天由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖第32頁,共71頁，2024年2月25日，星期天單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對數(shù)量信道(channel)第33頁,共71頁，2024年2月25日，星期天雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細(xì)胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖第34頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1.雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度第35頁,共71頁，2024年2月25日，星期天雙參數(shù)直方圖點圖第36頁,共71頁，2024年2月25日，星期天2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。第37頁,共71頁，2024年2月25日，星期天二維等高圖第38頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.假三維等高圖第39頁,共71頁，2024年2月25日，星期天（三）三參數(shù)直方圖第40頁,共71頁，2024年2月25日，星期天多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析第41頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設(shè)門分析技術(shù)第42頁,共71頁，2024年2月25日，星期天A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門第43頁,共71頁，2024年2月25日，星期天線性門第44頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Region設(shè)置:

區(qū)閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對應(yīng)，但是也可以包含于門。第45頁,共71頁，2024年2月25日，星期天D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

第46頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第47頁,共71頁，2024年2月25日，星期天外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 分離單個核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液一、免疫檢測樣品制備第48頁,共71頁，2024年2月25日，星期天新鮮實體組織單細(xì)胞懸液的制備機械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第49頁,共71頁，2024年2月25日，星期天適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色第50頁,共71頁，2024年2月25日，星期天FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料第51頁,共71頁，2024年2月25日，星期天名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料第52頁,共71頁，2024年2月25日，星期天 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復(fù)合染料第53頁,共71頁，2024年2月25日，星期天PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機制第54頁,共71頁，2024年2月25日，星期天熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式

結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價鍵結(jié)合 熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法

直標(biāo):干擾少,但需購買多種單抗 間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體 組合標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記第55頁,共71頁，2024年2月25日，星期天免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用第56頁,共71頁，2024年2月25日，星期天微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）第57頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共71頁，2024年2月25日，星期天通過對標(biāo)記不同熒光素分子的檢測，實現(xiàn)FCM對可溶性物質(zhì)的定量分析第59頁,共71頁，2024年2月25日，星期天四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細(xì)胞實體組織來源標(biāo)本用機械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控第60頁,共71頁，2024年2月25日，星期天溫度pH染料濃度固定劑（二）免疫熒光染色的質(zhì)控第61頁,共71頁，2024年2月25日，星期天光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn):保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數(shù)校準(zhǔn):保證計數(shù)的準(zhǔn)確性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）儀器操作的質(zhì)控第62頁,共71頁，2024年2月25日，星期天同型對照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測，結(jié)果達靶值，提示本次實驗結(jié)果可靠。（四）免疫檢測的質(zhì)控第63頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)在免疫學(xué)檢驗中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面的抗原成分進行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。第64頁,共71頁，2024年2月25日，星期天T淋巴細(xì)胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細(xì)胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析第65頁,共71頁，2024年2月25日，星期天二、淋巴細(xì)胞功能分析細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(死細(xì)胞與活細(xì)胞比例