核酸提取與鑒定

關(guān)于核酸提取與鑒定1

核酸的提取與鑒定第一節(jié)預(yù)處理第二節(jié)DNA的提取

第三節(jié)RNA的提取

第四節(jié)核酸的鑒定概述第2頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天研究對(duì)象：基因組DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA、mRNA過(guò)程：

裂解：破碎細(xì)胞，使細(xì)胞中的核酸游離在裂解體系中

純化：使核酸與其它雜質(zhì)徹底分離，如蛋白質(zhì)、鹽等一、概述

總原則：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。鑒定：濃度、純度、分子量、測(cè)序（技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)等）第3頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、植物樣品

新鮮組織先用無(wú)菌生理鹽水洗；干藥材除去霉點(diǎn)，無(wú)菌水浸洗；

（一）樣品預(yù)處理（獲取分散細(xì)胞）

搗碎或剪碎；加液氮研磨成粉狀。第4頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、動(dòng)物樣品（1）組織樣品：新鮮樣品，生理鹽水洗，直接使用（或分裝、-70℃/液氮低溫保存）；甲醛固定組織要先去掉甲醛；石蠟包埋組織要經(jīng)過(guò)組織切片和二甲苯脫蠟等處理。第5頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）血細(xì)胞樣品：（3）培養(yǎng)細(xì)胞：

離心，棄細(xì)胞培養(yǎng)液；用緩沖液多次漂洗；來(lái)源：新鮮血液或者凍貯血液；抗凝劑：一般用EDTA-Na2或檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉），不可使用肝素；分離：紅白細(xì)胞，一般用明膠，加緩沖液懸浮白細(xì)胞。（血清DNA是研究腫瘤的材料之一）第6頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、微生物培養(yǎng)物樣品離心獲取菌體細(xì)胞，加緩沖液洗滌，加緩沖液懸浮菌體細(xì)胞。4、微生物混合樣品用緩沖液懸浮菌體，低速離心，沉淀雜質(zhì)。高速離心獲取菌體細(xì)胞。用緩沖液洗滌菌體細(xì)胞。加緩沖液懸浮菌體細(xì)胞。第7頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）提取用具預(yù)處理1、DNA提取用具的處理要求無(wú)菌；試劑、器材高壓干燥等進(jìn)行無(wú)DNA酶處理。2、RNA提取用具的處理要求無(wú)菌，防止二次污染。RNA易被RNase水解，RNase無(wú)處不在且耐高溫，提取條件要求嚴(yán)格。第8頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、真核生物基因組DNA的常規(guī)提取裂解細(xì)胞，溶出DNA除去雜質(zhì)重新溶解DNA沉淀、濃縮DNA第9頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天

⒈破碎細(xì)胞，溶解DNA：用提取液（裂解液）破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核膜。微生物樣品提取液：含表面活性劑SDS、溶菌酶等動(dòng)物樣品提取液：含SDS、蛋白酶K等植物樣品提取液：含CTAB核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合劑（如EDTA，檸檬酸等），螯合這些離子。第10頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、除去雜質(zhì)（主要是蛋白質(zhì)）

（SDS，破膜、蛋白質(zhì)變性沉淀）——苯酚抽提蛋白質(zhì)——氯仿抽提、萃取苯酚經(jīng)離心后溶液分為三層：上層是核酸溶液、中間不溶物為變性蛋白質(zhì)，下層是苯酚氯仿溶液。蛋白質(zhì)苯酚氯仿核酸溶液第11頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.沉淀DNA有機(jī)溶劑沉淀DNA：2倍體積無(wú)水乙醇（或1倍體積的異戊醇）再用75%乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA將DNA溶于水或TE溶液。第12頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃?；蚪MDNA－CTAB法第13頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。第14頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA提取的一般流程第15頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA特點(diǎn)：（1）細(xì)菌基因組DNA以外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）大都含有抗生素抗性基因。（3）可自我復(fù)制或表達(dá)。（重組DNA技術(shù)中構(gòu)建載體）（4）大小1-300kb。第16頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、培養(yǎng)細(xì)菌和擴(kuò)增質(zhì)粒

加適當(dāng)?shù)囊种苿ㄈ缏让顾兀?，抑制?xì)菌蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞分裂，但質(zhì)粒會(huì)繼續(xù)復(fù)制。

第17頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、收獲細(xì)菌和溶菌

離心收集細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌裂解方法：機(jī)械法化學(xué)試劑法（SDS）溶菌酶－化學(xué)試劑聯(lián)合法（最常用）第18頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、分離質(zhì)粒DNA基因組DNA與質(zhì)粒DNA分離堿裂解法（最常用）用溶液1（EDTA）懸浮菌體。溶液2（NaOH和SDS）裂解菌體，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性。溶液3中和pH，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，基因組DNA不復(fù)性與蛋白質(zhì)形成絮狀沉淀。離心后，質(zhì)粒DNA留在上清液中。第19頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)加熱，使細(xì)菌裂解、蛋白質(zhì)和DNA變性。降低溫度，質(zhì)粒DNA復(fù)性留于上清液，基因組DNA復(fù)性很慢與蛋白質(zhì)形成沉淀，可通過(guò)離心除去。煮沸裂解法（偶爾用）梯度離心法（極少用）基因組DNA斷裂，吸附大量EB，密度大；質(zhì)粒DNA密度小。利用氯化銫梯度離心，分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA。第20頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天離心分離后，吸取含有質(zhì)粒DNA的上清液。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白質(zhì)。用乙醇或異戊醇沉淀質(zhì)粒DNA（與基因組DNA方法同）。4、質(zhì)粒DNA的純化蛋白質(zhì)苯酚氯仿核酸溶液第21頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、RNA的提取（一）總RNA的提取所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：①樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性；③對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；⑤對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。

——最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。第22頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：可裂解細(xì)胞并抑制RNA酶，目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑。RNA酶的蛋白抑制劑(RNAsin)等。第23頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）提取RNA所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備塑料制品：使用滅菌的一次性用品?；蛴?.1％DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用氯仿處理）。玻璃用品：使用前于180℃的高溫下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再用3％H2O2室溫浸泡10min，然后用0.1％DEPC水沖洗，晾干。

第24頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，所有溶液均應(yīng)用0.1％DEPC于37℃處理12小時(shí)以上，然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。第25頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在涉及RNA的一切操作過(guò)程中，都應(yīng)戴一次性手套和口罩，應(yīng)勤換手套。

（2）RNA提取中RNase污染的控制

第26頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天第27頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA的提取方法

1、異硫氰酸胍-氯化銫超速離心法使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶的活性；再進(jìn)行CsCl密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清液中。這種方法能得到高質(zhì)量的RNA，同時(shí)分離出細(xì)胞染色體DNA。第28頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法利用鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，抑制RNA酶；3、氯化鋰-尿素法利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶；氯化鋰選擇性沉淀RNA。其缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會(huì)丟失一些小分子RNA。第29頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、一步快速熱酚抽提法將異硫氰酸胍、巰基乙醇和去污劑SDS等聯(lián)合使用，抑制RNA的降解，裂解細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離；用高溫苯酚、氯仿等抽提去除蛋白質(zhì)和DNA，乙醇或異丙醇沉淀純化RNA。此法操作簡(jiǎn)便快速，可在3小時(shí)以內(nèi)處理大批樣品，對(duì)大量或少量組織的細(xì)胞RNA提取均甚合適。

第30頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、試劑盒快速提取法裂解液含胍鹽，抑制RNA酶，使蛋白質(zhì)和DNA同時(shí)變性；氯仿等抽提去除蛋白質(zhì)和DNA；乙醇或異丙醇沉淀純化RNA；此法操作簡(jiǎn)便快速。

第31頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天Trizol一步提取總RNA：TRIzol的主要成分是異硫氰酸胍和苯酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase。第32頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）實(shí)驗(yàn)前取冰，4℃離心機(jī)預(yù)冷，DEPC處理水（高壓滅菌處理）配制的75%乙醇4℃預(yù)冷；步驟：2）1mlTrizol勻漿好的樣品；3）加入0.2ml氯仿，顛倒混勻（15秒）——“慢”，氯仿使蛋白變性4）室溫，靜置3分鐘；5）離心機(jī)4℃、14000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘；靜置1分鐘（分層即可；樣品會(huì)分成三層：下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要存在于水相中）6）取上清0.5ml（注意：取最上層水相，小心污染，寧可吸少點(diǎn)也不要吸到中間層的物質(zhì)）放入另一個(gè)1.5ml的EP管中；7）加入等體積的異丙醇（0.5ml），渦旋混勻；第33頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天8）室溫，靜置10分鐘（該條件由Trizol試劑盒提供；其他提供的條件用-20℃、1小時(shí)，目的為了更好分層）9）離心機(jī)4℃、14000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘10）棄上液(移液器調(diào)至1ml，分兩步快速輕輕吸棄上清：第1步，沿液面吸棄約0.9ml上清；第2步，沿液面吸棄其余上清;注意吸頭不要接觸到沉淀斑區(qū)）11)沿試管內(nèi)壁輕輕加入1ml4℃預(yù)冷的75%乙醇,注意切勿沖擊到沉淀斑區(qū)12）離心機(jī)4℃、10000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘13）棄上液（用槍把里面的乙醇吸去，留極少許即可，以防干燥過(guò)程中把RNA烤干），60℃恒溫箱干燥5分鐘（注意：打開(kāi)管蓋；或用真空干燥5分鐘）14）加入50μlDEPC處理水溶解（可以根據(jù)管底的白色沉淀判斷RNA量的多少加DEPC處理水）15）-80℃冰箱保存。第34頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織勻漿

第35頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（二）mRNA的提取從總RNA中分離mRNA，用Oligo（dT）層析柱。mRNA含polyA，在高鹽濃度條件下與Oligo（dT）結(jié)合，其他成分被洗掉，再用低鹽濃度洗脫mRNA。第36頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）核酸濃度檢測(cè)OD260＝1時(shí)（比色皿厚度1.0cm）雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml。DNA(μg/ml)=OD260×50RNA（μg/ml）=OD260×40五、核酸的鑒定第37頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）核酸純度檢測(cè)（紫外吸收法）核酸在260nm處有吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm有吸收峰核酸的純度用OD260/OD280比值表示。

DNA樣品：OD260/OD280

＝1.8，DNA純度高OD260/OD280>1.8，含RNA，或DNA部分降解OD260/OD280<1.8，含苯酚或蛋白雜質(zhì)RNA樣品：

OD260/OD280

＝1.8~2.0—RNA純度高

<1.8，含蛋白雜質(zhì)；>2.0，RNA出現(xiàn)降解第38頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）核酸完整性檢測(cè)核酸樣本的完整性和分子量可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定（RNA常采用甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳），溴化乙錠染色，紫外燈觀察。凝膠上RNA存在處可觀察到清晰的條帶。完整性良好的總RNA應(yīng)該清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三條帶，其中28srRNA的亮度應(yīng)為18srRNA的兩倍，5srRNA較弱。電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移。第39頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)電泳支持介質(zhì)分為瓊脂糖凝膠電泳：多用于鑒定較大核酸片段（0.1~60kb）聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于鑒定較小的核酸片段（50~1000bp）六、電泳第40頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的一種多糖。凝膠具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖濃度(％)線型DNA分子的分離范圍(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2第41頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳裝置

第42頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳有許多優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，分離核酸范圍廣；電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好；電泳后區(qū)帶易染色，便于定量測(cè)定；可用于核酸的純化和分離（電洗脫法）；可制成干膜可長(zhǎng)期保存。

第43頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，但是無(wú)法確定分