組織制片技術(shù)概述

關(guān)于組織制片技術(shù)概述組織制片技術(shù)第2頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

組織制片技術(shù)的概述組織制片技術(shù)的方法組織制片技術(shù)的基本程序蘇木精—伊紅染色第3頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

組織制片技術(shù)的發(fā)展史

從16世紀(jì)60年代Hook發(fā)明顯微鏡，開始觀察和描述軟木塞中的細(xì)胞至今，組織制片技術(shù)隨著生命科學(xué)的發(fā)展而不斷進(jìn)步。第4頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

組織制片技術(shù)的發(fā)展史

在19世紀(jì)中期，隨著生物、物理和化學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，以及顯微鏡和切片機(jī)的逐步完善，組織學(xué)也建立起一整套完整科學(xué)的組織制片技術(shù)。第5頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

組織制片技術(shù)的發(fā)展史

特別是20世紀(jì)50年代以來，由于組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等新技術(shù)和新儀器的出現(xiàn)，使組織制片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。第6頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標(biāo)本，顯示了組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、組織細(xì)胞之間的相互連接及組織細(xì)胞中的某些化學(xué)成分的種類和含量。組織制片是研究醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)最基本的手段。組織制片的意義和目的第7頁,共63頁，2024年2月25日，星期天組織制片技術(shù)的方法

非組織切片法組織切片法第8頁,共63頁，2024年2月25日，星期天非組織切片法組織不經(jīng)過切片制成觀察標(biāo)本的方法。非組織切片法的種類涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標(biāo)本、活體標(biāo)本、整裝標(biāo)本、血管注射標(biāo)本。第9頁,共63頁，2024年2月25日，星期天涂片將所采的血液、骨髓或者脫落細(xì)胞涂抹于載玻片上經(jīng)瑞氏、姬姆薩染色、常規(guī)HE染色。第10頁,共63頁，2024年2月25日，星期天壓片

先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學(xué)藥品進(jìn)行軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上。例如運(yùn)動(dòng)終板和寄生蟲標(biāo)本等。第11頁,共63頁，2024年2月25日，星期天鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經(jīng)過固定、染色等程序制成。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。第12頁,共63頁，2024年2月25日，星期天磨片：對(duì)于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進(jìn)行染色封固在載玻片上。第13頁,共63頁，2024年2月25日，星期天消化分離標(biāo)本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)將細(xì)胞間質(zhì)消化溶解，再用機(jī)械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個(gè)而又完整的細(xì)胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進(jìn)行封固。例如平滑肌分離標(biāo)本，脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞等。第14頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

活體標(biāo)本將所采的觀察標(biāo)本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察：微生物運(yùn)動(dòng)第15頁,共63頁，2024年2月25日，星期天整裝標(biāo)本

①將胚胎或小動(dòng)物經(jīng)前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明容器中

。②將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經(jīng)固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標(biāo)本。第16頁,共63頁，2024年2月25日，星期天血管注射標(biāo)本

①將有色物質(zhì)注射進(jìn)血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標(biāo)本。②將有色物質(zhì)注射進(jìn)血管后，經(jīng)一系列制片技術(shù)處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標(biāo)本。第17頁,共63頁，2024年2月25日，星期天組織切片法

利用化學(xué)試劑將組織經(jīng)過一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物滲透進(jìn)組織內(nèi)部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機(jī)將包埋好的組織塊切成以微米計(jì)的薄片，再根據(jù)需要進(jìn)行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標(biāo)本的方法。

第18頁,共63頁，2024年2月25日，星期天組織切片法的種類

冰凍切片石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片第19頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

冰凍切片將所取材的新鮮組織，經(jīng)快速冷凍后再切片，以保持組織內(nèi)所含的脂類或某些酶類的活性。為觀察急待結(jié)果的組織，如臨床手術(shù)所取組織第20頁,共63頁，2024年2月25日，星期天石蠟組織切片標(biāo)本制作的基本程序:

1.取材→2.固定和固定后處理→

3.脫水→4.透明→

5.浸蠟與包埋→

6.切片→

7.染色→

8.封固

第21頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

取材一、動(dòng)物的處死手法迅速、快捷。

常用方法：

1.麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。

2.空氣栓塞法：耳靜脈，20－30ml空氣

3.擊頭法：重物猛擊，迅速致死。

4.頸椎脫臼法：小白鼠

5.破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙

6.股動(dòng)脈放血：麻醉后放血使大動(dòng)物迅速死亡。第22頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、取材的步驟

選擇動(dòng)物選擇取材部位選擇切面方向

第23頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)工作的目的和經(jīng)濟(jì)能力選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

肝臟—豬肝卵巢—貓胃—狗運(yùn)動(dòng)終板—爬蟲類動(dòng)物肥大細(xì)胞—大、小白鼠的皮下組織間皮和內(nèi)皮—蛙的腸系膜第24頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇取材部位

胰腺—胰尾部脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元—頸膨大和腰膨大處肺—肺門胃—胃底部

第25頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇取材時(shí)切面的方向

腎臟—腎門處作縱切頭皮—順毛根的方向縱切大小腸的環(huán)行皺襞—縱切氣管和食管—橫切第26頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、取材時(shí)應(yīng)注意的問題：

組織新鮮：取材動(dòng)作快捷，迅速投入固定液注意環(huán)境溫度的影響：冰上取材或者冷固定材料應(yīng)小而?。翰怀^1.5×1.5×0.5cm3

固定液會(huì)造成組織收縮，注意保持組織原有形態(tài)取材手術(shù)器械鋒利規(guī)范操作，防止組織損害注意取材環(huán)境和器械干凈，防止組織污染第27頁,共63頁，2024年2月25日，星期天固定和固定后處理一、固定的目的：

固定劑使細(xì)胞的成分凝固，防止組織細(xì)胞自溶和腐敗，保持細(xì)胞生活時(shí)的狀態(tài)。固定劑的酶染作用使細(xì)胞各成分易于被染料著色。使組織適度硬化，利于制作薄片。第28頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、固定的方法：

1.直接固定：最常用。

2.蒸汽固定：1－2％鋨酸或者甲醛揮發(fā)的蒸汽，多用于涂片固定。

3.灌注固定：（必須進(jìn)行后固定）

局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟全身灌注固定：神經(jīng)系統(tǒng)第29頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、固定的注意事項(xiàng)：固定劑的用量一般為組織塊體積的15倍左右固定劑的配制現(xiàn)配現(xiàn)用預(yù)固定固定的時(shí)間一般過夜或者24小時(shí)可達(dá)到固定要求。第30頁,共63頁，2024年2月25日，星期天四、常用固定劑單純固定劑

甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重鉻酸鉀、丙酮、鉻酸、四氧化鋨

固定組織時(shí)，只單用某一種試劑尚難對(duì)各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據(jù)對(duì)組織的作用與反應(yīng)，配成混合固定劑，以求得補(bǔ)償某試劑對(duì)組織所致的缺陷?；旌瞎潭▌?/p>

4%多聚甲醛液、乙醇—甲醛液、Bouin氏液、苦味酸—硫酸液、Carnoy氏液、Helly氏液第31頁,共63頁，2024年2月25日，星期天甲醛(Formeldedhyde)固定濃度：4%甲醛溶液固定時(shí)間：12小時(shí)—24小時(shí)固定后處理：流水沖洗12小時(shí)—24小時(shí)配制方法：甲醛10ml+生理鹽水/蒸溜水90ml特性：甲醛放置時(shí)間過長易產(chǎn)生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后變?yōu)榧姿幔谷芤鹤優(yōu)樗嵝?，?yán)重時(shí)可影響到細(xì)胞著色。第32頁,共63頁，2024年2月25日，星期天乙醇(Ethylalcohol)固定濃度：80%--90%乙醇液固定時(shí)間：一般4小時(shí)—12小時(shí)固定后處理：直接入脫水劑配制方法：無水乙醇+蒸餾水特性：乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時(shí)間過長時(shí)，易發(fā)脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內(nèi)脂肪、類脂體、色素等，注意制片的目的。第33頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4%多聚甲醛液配制方法：

多聚甲醛4g0.1MPBS溶液100ml

固定時(shí)間：24小時(shí)固定溫度4℃固定后處理：流水沖洗24小時(shí)適用組織：常用固定劑，適用廣泛第34頁,共63頁，2024年2月25日，星期天乙醇—甲醛液（A—F液）配制方法：95%乙醇90ml40%甲醛10ml

固定時(shí)間：組織塊固定4—12小時(shí)，鋪片固定5—10分鐘。固定后處理：直接入脫水劑。適用組織：肥大細(xì)胞，糖原的固定

。第35頁,共63頁，2024年2月25日，星期天Bouin氏液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml40%甲醛25ml

冰乙酸5ml固定時(shí)間：12—24h固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產(chǎn)生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。第36頁,共63頁，2024年2月25日，星期天五、固定后處理

除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產(chǎn)生的沉淀、結(jié)晶和色素的步驟稱為固定后處理。主要有以下六種方法：流水沖洗

：重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經(jīng)過流水沖洗24h。酒精脫黃:含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經(jīng)過70％乙醇洗滌脫去黃色。第37頁,共63頁，2024年2月25日，星期天碘酒脫汞

：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。脫甲醛色素

：甲醛長期固定的組織易產(chǎn)生黑色結(jié)晶，70％乙醇－濃氨水溶液除去。組織漂白：鋨酸固定的組織為黑色。漂白液漂白才上色。脫鈣：含鈣組織骨、牙齒和內(nèi)耳。第38頁,共63頁，2024年2月25日，星期天脫水一、脫水用某種能與透明劑互溶的化學(xué)試劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來的過程。要點(diǎn)：緩慢、徹底、勿過度。二、常用脫水劑

乙醇、丙酮、正丁醇第39頁,共63頁，2024年2月25日，星期天乙醇固定劑+脫水劑上行酒精脫水70%（30%）→100%，以10％遞增。丙酮脫水強(qiáng)，但對(duì)組織的收縮脆化作用也強(qiáng)；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護(hù)某些特殊染色的標(biāo)本不被褪色。第40頁,共63頁，2024年2月25日，星期天透明一、透明對(duì)組織的最后脫水處理。在經(jīng)過前一階段的“脫水”后，還要借某種有機(jī)溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質(zhì)相溶而浸滲。二、常用透明劑

二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷、冬青油第41頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二甲苯

為無色透明的液體，易揮發(fā)，長期接觸對(duì)呼吸道粘膜有較強(qiáng)的刺激作用20分鐘—1個(gè)小時(shí)，大塊組織可適當(dāng)延長時(shí)間。作用迅速，浸泡時(shí)間過長易發(fā)生過度收縮和脆化苯甲酸甲脂為無色透明的液體，易揮發(fā)透明作用較二甲苯緩慢，透明時(shí)間12--24小時(shí)。對(duì)組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明第42頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟組織透明后，用石蠟置換組織內(nèi)部的透明劑的過程稱為浸蠟。組織塊浸蠟一般先經(jīng)過低熔點(diǎn)蠟，再經(jīng)過高熔點(diǎn)蠟。

包埋

第43頁,共63頁，2024年2月25日，星期天高溶點(diǎn)蠟也稱硬蠟溶點(diǎn)在60℃--62℃硬蠟箱的溫度控制在62℃--64℃之間組織浸蠟時(shí)間一般不超過1小時(shí)

低溶點(diǎn)蠟也稱軟蠟溶點(diǎn)在48℃--50℃

軟蠟箱的溫度控制在52℃—54℃之間組織浸蠟時(shí)間一般可達(dá)2—4小時(shí)第44頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、包埋組織浸蠟完成后，接著進(jìn)行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。修整蠟塊時(shí)，組織塊應(yīng)距蠟塊邊緣2—3毫米，以利于連續(xù)切片。

第45頁,共63頁，2024年2月25日，星期天切片

石蠟切片組織切片中應(yīng)用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作的切片。易于制作大量菲薄的組織標(biāo)本，而且包埋塊可長期保存。第46頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、儀器及器材第47頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、切片過程：

調(diào)節(jié)恒溫水箱水溫至47℃左右；固定蠟塊于固定器；快修裝置修整包埋面；調(diào)節(jié)切片厚度至4—6微米；連續(xù)切片；攤片于水箱內(nèi)；將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上；置于溫箱內(nèi)烤片。第48頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、切片的注意事項(xiàng)

①切片前要將切片機(jī)各部位的螺絲旋緊，否則會(huì)引起切片機(jī)各部件震動(dòng)，造成切片厚薄不勻。②包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應(yīng)按切片機(jī)刀臺(tái)上的刻度作適當(dāng)調(diào)整。③恒溫水箱的溫度應(yīng)比包埋蠟的溶點(diǎn)低5℃--6℃。第49頁,共63頁，2024年2月25日，星期天染色

一、染料

指分子中含有發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)的有機(jī)化合物，有鮮艷的色彩，對(duì)于組織有極強(qiáng)的親和力。根據(jù)來源可分為兩類：天然染料（卡紅、蘇木精）人工合成染料（苦味酸、桔黃G）根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)分為：堿性染料(basicdye)

酸性染料(aciddye)

中性(neutrophilia)染料等第50頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、染色的原理

染色就是染料和組織細(xì)胞的分子相互結(jié)合，使組織和細(xì)胞著色?；瘜W(xué)反應(yīng)在組織細(xì)胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)。染色時(shí)酸性物質(zhì)與堿性染料結(jié)合；堿性物質(zhì)與酸性染料結(jié)合。細(xì)胞核中主要由酸性物質(zhì)組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強(qiáng)的親和力。細(xì)胞質(zhì)主要由堿性物質(zhì)組成，所以與伊紅等酸性染料有很強(qiáng)的親和力。能被堿性染料著色的物質(zhì)：嗜堿性(basophilia)；能被酸性染料著色的物質(zhì)：嗜酸性(acidophilia)。第51頁,共63頁，2024年2月25日，星期天物理反應(yīng)細(xì)胞中有許多微小的毛細(xì)小孔，染料的色素離子通過這些小孔滲入細(xì)胞內(nèi)，染料與細(xì)胞沒有牢固的結(jié)合，但分散的色素離子和組織細(xì)胞分子之間通過分子間相互作用使細(xì)胞著色。第52頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、染色的注意事項(xiàng)：1.溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長時(shí)間。3.溫度：高，染色效果明顯。4.適當(dāng)使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑：能增強(qiáng)染料對(duì)組織的著色能力，其本身與染料或組織不發(fā)生結(jié)合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時(shí)添加的鉀明礬、銨明礬等。促染劑：能增強(qiáng)染料對(duì)組織的著色能力，本身并不參與染色反應(yīng)。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與周圍組織對(duì)比鮮明，著色深淺適當(dāng)；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。第53頁,共63頁，2024年2月25日，星期天封固一、封固最后一道程序是滴加封固劑，用蓋玻片覆蓋，以利于鏡下觀察。阻斷組織片與外界的接觸，防止組織片脫片、受潮、干裂、機(jī)械磨損等，延長切片的使用時(shí)間。這一步驟稱為封固。封固分為干封和濕封兩種。第54頁,共63頁，2024年2月25日，星期天干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。數(shù)年不褪色。濕封：切片染色后直接用含甘油、明膠及少量的水和防腐劑組成的封固劑封固。濕封的標(biāo)本保存時(shí)間不長，主要用于某些組織化學(xué)或特殊染色的標(biāo)本。第55頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、封固時(shí)的注意事項(xiàng)：①

封固時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。②

封固劑應(yīng)濃度適中。③

選擇大小合適的蓋玻片，以蓋好組織后四周約有2毫米左右的間隙為適當(dāng)。④

封固劑應(yīng)避光保存

。

第56頁,共63頁，2024年2月25日，星期天組織脫水、透明步