遺傳與基因工程課件

遺傳與基因工程一、遺傳1、不同研究水平：

個(gè)體（研究內(nèi)容、變異來源）分子（微觀、人為干預(yù)DNA）群體（宏觀、進(jìn)化）雜交在同一物種內(nèi)進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因技術(shù)則沒有限制。雜交沒有人工的基因植入，轉(zhuǎn)基因工程人工直接改造DNA，更難以控制一對(duì)容易混淆的概念遺傳學(xué)之父孟德爾（1822－1884）2、歷史回顧1866年，孟德爾（G.J.Mendel）提出了遺傳因子（hereditaryfactor）的概念。他將控制豌豆性狀的遺傳因素稱之為遺傳因子形成了基因的雛形。1909年，丹麥的遺傳學(xué)家W.Johanssen根據(jù)希臘語“給予生命”之義，創(chuàng)造了“gene”一詞。但它只是一個(gè)抽象的單位，并不代表物質(zhì)實(shí)體。

1910年，美國遺傳學(xué)家摩爾根（T.H.M.organ）以果蠅為研究材料，發(fā)現(xiàn)了連鎖交換定律并提出遺傳粒子學(xué)說，第一次將代表某一特定性狀的基因與某一特定的染色體聯(lián)系起來，即基因位于染色體上。1944年，美國微生物學(xué)家O.T.Avery首次證實(shí)遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)是DNA，基因位于DNA上。1953年Watson和Crick揭示了DNA的雙螺旋分子結(jié)構(gòu)

1960年，F(xiàn).Jacob和J.Monmd提出了操縱元（操縱子）的概念，揭示了原核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要規(guī)律。1972年，重組DNA分子建立，標(biāo)志著基因工程誕生。二、基因工程

１、定義

基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。這種技術(shù)是在生物體外，通地對(duì)DNA分子進(jìn)行人工剪切和拼接，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生人類所需要的基因產(chǎn)物。通俗地說，就是按照人們的意愿，把一種生物的個(gè)別基因復(fù)制出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀?；蚬こ袒蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)實(shí)質(zhì)基因重組2、生物技術(shù)四大支柱基因是一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。3、基因DNA的結(jié)構(gòu)原核基因組成真核基因組成4、基因工程簡介基因操作的工具基因工程的技術(shù)路線基因操作的工具基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶基因的針線——DNA連接酶基因的運(yùn)載工具——載體限制性內(nèi)切酶

限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶。特點(diǎn)：特異性。即一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。

寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象

寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象，簡稱R/M體系，同免疫體系類似，它能夠辨別自己的DNA和外來的DNA，并使后者降解掉。有關(guān)寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，它是由兩種酶活性配合完成的，一種叫修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種叫核酸內(nèi)切限制酶。

寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，它的存在有兩方面的作用，一是保護(hù)自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。根據(jù)限制－修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)在已成為重組DNA技術(shù)學(xué)的重要工具酶。

基本特性絕大多數(shù)的II型核酸內(nèi)切限制酶，都能夠識(shí)別由4～8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列，這些識(shí)別序列又稱核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)或靶子序列，它們有一個(gè)共同特點(diǎn)：具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，換言之這些核苷酸對(duì)的順序是呈回文結(jié)構(gòu)。

核酸內(nèi)切限制酶酶切造成的DNA分子的斷裂類型：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段；兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，形成具有平末端的DNA片段。

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶限制酶

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。酶切反應(yīng)系統(tǒng)：底物DNA

核酸內(nèi)切限制酶緩沖液（Tris-HCI、Mg)

溫度(37)

基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。

DNA連接酶

1967年，世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。這種酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個(gè)游離的羥基和在另一條DNA鏈5’-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)，而且還需要有一種能源分子的存在才能實(shí)現(xiàn)這種連接反應(yīng)。

值得注意的一點(diǎn)是，DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。分類：

大腸桿菌DNA連接酶：（平末端)T4噬菌體DNA連接酶（平末端、黏性末端）

由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)混合物中會(huì)發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)。為了克服這一缺點(diǎn)，一般是用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶，預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5’磷酸基團(tuán)。連接酶反應(yīng)系統(tǒng)：（類似酶切）

連接酶連接缺口DNA的最佳反應(yīng)溫度是37℃。但是在這個(gè)溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，尤其是對(duì)于那些粘性末端配對(duì)堿基數(shù)少而且多為A-T的限制性片段，因此，連接粘性末端的最佳溫度，應(yīng)該是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為4～15℃比較合適。載體必須具備條件載體1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。常用的運(yùn)載體主要有兩類：

1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒

2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒質(zhì)粒：

質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中核區(qū)外的DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體。絕大多數(shù)細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子。有的一個(gè)細(xì)菌中有一個(gè)，有的一個(gè)細(xì)菌中有多個(gè)。大腸桿菌的質(zhì)粒

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成。質(zhì)粒的生物學(xué)特性：

1、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：

SC型共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA）

OC型開環(huán)DNA（ocDNA）

L型線性DNA（cDNA）

2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：

106~108D

3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：

復(fù)制基因（replicator）、選擇性記號(hào)、克隆位點(diǎn)

質(zhì)粒DNA的分離與純化

1、氯化銫密度梯度離心法；

2、堿變性法；

1、氯化銫密度梯度離心法

1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；

2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；

3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。2.堿變性法：

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在PH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。

通過冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建

天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。

pBR322質(zhì)粒載體“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX

pUC質(zhì)粒載體人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。

AmproripUC18(3kb)MCS

(Multiplecloningsites,

多克隆位點(diǎn)）LacpromoterlacZ’

噬菌體載體（Bacteriophage，簡稱phage）

噬菌體的溶源生命周期溶源生長周期：

是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。

λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)

溶菌階段(復(fù)制和釋放)

溶源階段

(整合到寄主染色體上)DNAProteincoatcoscosNonessential

regionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpVirusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)體外包裝

λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。

λ噬菌體的包裝限制為野生噬菌體DNA（約48.5kb）的75%~105%。根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來進(jìn)行重組子的篩選其他載體

柯斯質(zhì)粒載體

YAC克隆載體柯斯質(zhì)粒載體cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)?？滤官|(zhì)粒載體的特點(diǎn)具有質(zhì)粒載體的特性；具有λ噬菌體的特性；具有較高容量的克隆能力；YAC載體：人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要基因操作的基本步驟1）提取目的基因2）目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）重組子的篩選和表達(dá)步驟1、提取目的基因

目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。一定是結(jié)構(gòu)基因？目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫)根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法（基因組文庫）鳥槍法（gunshot散彈射擊法）：用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來。反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA克隆的優(yōu)越性cDNA克隆以mRNA為材料，這對(duì)于有些RNA病毒來說是特別適用的；cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行；由于每個(gè)cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低；根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成三種目的基因提取的方法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡單基因步驟2：目的基因與運(yùn)載體重組1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。常用的受體細(xì)胞（優(yōu)缺點(diǎn)）

微生物、動(dòng)物、植物細(xì)胞等。常用導(dǎo)入方法：步驟3：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

微生物（轉(zhuǎn)化）

1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。（感受態(tài)細(xì)胞）

2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。

3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染顯微注射植物細(xì)胞農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法

Ti質(zhì)?？煞譃?個(gè)區(qū)：⑴T-DNA區(qū)。T-DNA是農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)；⑵Vir區(qū)，該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，稱為毒性區(qū)；⑶Con區(qū)，該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，稱為接合轉(zhuǎn)移區(qū)；⑷Ori區(qū)，該區(qū)段基因調(diào)控質(zhì)粒的自我復(fù)制，稱為復(fù)制起始區(qū)。步驟4：重組子的篩選載體遺傳表型直接篩選法（雙抗、藍(lán)白斑）雙酶切法（電泳）核酸分子雜交檢測法（三種）DNA序列測定法(Sanger測序）基因表達(dá)產(chǎn)物分析法（Pro、生化方法）

不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲基因再進(jìn)行修飾。真核基因與原核表達(dá)系統(tǒng)不同表達(dá)不同（轉(zhuǎn)錄、翻譯）5、基因工程的主要技術(shù)及原理離心電泳PCR擴(kuò)增分子雜交DNA測序離心低速離心機(jī)高速離心機(jī)（低溫）核酸的凝膠電泳基本原理

帶有負(fù)電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。

用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)DNA片斷大小的估算

凝膠電泳的分辨力：

與凝膠的類型和密度相關(guān)瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間;

聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之間電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子遷移率要快

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴(kuò)增法。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。核酸分子雜交技術(shù)原理：帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)Northern雜交不同之處（Southern)

雜交對(duì)象電泳條件菌落雜交

也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。鑒定重組子。檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)DNA核苷酸序列分析Sanger雙脫氧鏈終止法原理：雙脫氧鏈終止法要求使用一種單鏈的DNA模板和一種適當(dāng)?shù)腄NA合成引物。利用DNA聚合酶的兩種酶催化反應(yīng)的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的延長。

DNA測序分析的自動(dòng)化用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作熒光劑，預(yù)先標(biāo)記M13引物DNA5’-末端，按標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧鏈終止法同引物進(jìn)行反應(yīng)，用聚丙烯酰胺電泳分析。在電泳過程中，用激光激發(fā)電泳的片斷產(chǎn)生熒光，被熒光感受器接受，最終轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，被計(jì)算機(jī)讀出，或打印出來6、基因工程的應(yīng)用人類健康（69%）植物(13%)動(dòng)物（８％）食品（５％）環(huán)境、能源（４％）基因工程藥物美國批準(zhǔn)上市的基因工程藥品有人類胰島素、人類生長因子、白介素、干擾素、牛型生長激素疫苗等。我國自1986年“863”計(jì)劃實(shí)施以來，至1998年已有14種基因工程藥物，3個(gè)基因工程疫苗和數(shù)十個(gè)重組診斷試劑投放市場?；蛑委煟褐咐眠z傳學(xué)的原理治療人類的疾病。目前人類基因治療主要集中在遺傳性疾病、腫瘤及某些傳染性疾病。至1997年初，全世界共記錄了2103例基因治療病例（美國1700例）。其中6