補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)

關(guān)于補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)補(bǔ)體：一組存在于人和脊椎動(dòng)物血清中及組織液中具有酶樣活性，不耐熱和功能上連續(xù)反應(yīng)的糖蛋白，是抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用的必要補(bǔ)充條件，在正常情況下，血清中的補(bǔ)體大多以無(wú)活性酶前體形式存在。第2頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天物理性質(zhì)：不穩(wěn)定，易受各種理化因素的影響，加熱，紫外線照射，機(jī)械震蕩，酸堿和酒精等因素均可破壞補(bǔ)體。滅活：56℃加熱30min即可滅活第3頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)功能

（1）溶菌和溶細(xì)胞作用：補(bǔ)體系統(tǒng)激活后，在靶細(xì)胞表面形成MAC，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解。（2）調(diào)理作用：補(bǔ)體激活過(guò)程中產(chǎn)生的C3b、C4b、iC3b都是重要的調(diào)理素，可結(jié)合中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體，因此，在微生物細(xì)胞表面發(fā)生的補(bǔ)體激活，可促進(jìn)微生物與吞噬細(xì)胞的結(jié)合，并被吞噬及殺傷。第4頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）引起炎癥反應(yīng)：在補(bǔ)體活化過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)C3a、C4a、C5a。它們又稱(chēng)為過(guò)敏毒素，與相應(yīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激發(fā)細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺之類(lèi)的血管活性物質(zhì)，從而增強(qiáng)血管的通透性并刺激內(nèi)臟平滑肌收縮。C5a還是一種有效的中性粒細(xì)胞趨化因子。第5頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）清除免疫復(fù)合物：機(jī)制為：①補(bǔ)體與Ig的結(jié)合在空間上干擾Fc段之間的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解離。②循環(huán)IC可激活補(bǔ)體，產(chǎn)生的C3b與抗體共價(jià)結(jié)合。IC借助C3b與表達(dá)CR1和CR3的細(xì)胞結(jié)合而被肝細(xì)胞清除。第6頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）免疫調(diào)節(jié)作用：①C3可參與捕捉固定抗原，使抗原易被APC處理與遞呈。②補(bǔ)體可與免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。③參與調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能。第7頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天補(bǔ)體激活的途徑：經(jīng)典途徑旁路途徑MBL途徑

相同點(diǎn)：三條途徑有共同的末端通路，即形成膜攻擊復(fù)合物溶解細(xì)胞。第8頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1、補(bǔ)體經(jīng)典途徑(classicalpathway)：是指以抗原抗體復(fù)合物為主要刺激物，使補(bǔ)體固有成分以C1、C4、C2、C3、C5～C9順序發(fā)生酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細(xì)胞溶解作用的補(bǔ)體活化途徑。第9頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、替代途徑（旁路途徑）:是指不經(jīng)C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子參與下，直接由C3b與激活物結(jié)合啟動(dòng)補(bǔ)體酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細(xì)胞溶解作用的補(bǔ)體活化途徑。在感染早期可為機(jī)體提供有效的防御機(jī)制。其激活物是病原微生物等提供接觸表面第10頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、MBL途徑：在感染早期，體內(nèi)分泌甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)和C反應(yīng)蛋白。MBL與細(xì)菌表面的甘露糖殘基結(jié)合，然后與絲氨酸蛋白酶結(jié)合形成MASP（MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶），MASP繼而水解C4和C2啟動(dòng)后序的酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細(xì)胞溶解作用的補(bǔ)體活化途徑。激活物（或激活劑）是炎癥期產(chǎn)生的蛋白和病原體。第11頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天三條途徑的區(qū)別見(jiàn)下表區(qū)別點(diǎn)經(jīng)典途徑旁路途徑MBL途徑激活物IgG1～3或IgM與Ag復(fù)合物脂多糖、酵母多糖、凝聚的IgA和IgG4MBL（甘露聚糖結(jié)合凝集素

）參與成分C1～C9C3，C5～C9，B、P、D因子同經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶C4b2bC3bBb同經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶C4b2b3bC3bnBb同經(jīng)典途徑所需離子Ca2＋

Mg2＋Mg2＋同經(jīng)典途徑作用參與特異性免疫在感染后期發(fā)作用參與非特性免疫，在感染后期發(fā)揮作用同經(jīng)典途徑第12頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天補(bǔ)體的來(lái)源、采集實(shí)驗(yàn)室常用豚鼠、兔的新鮮血清作為補(bǔ)體的來(lái)源。補(bǔ)體的采集：一般選用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以無(wú)菌操作采集血液，采集好的血液置4℃冰箱過(guò)夜，次日離心分離血清即可分離到補(bǔ)體。第13頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天溶血素（抗綿羊紅細(xì)胞抗體）：是以SRBC作為抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，無(wú)需進(jìn)一步提純，但試驗(yàn)前應(yīng)先56℃加熱30min或者60℃3min滅活補(bǔ)體。溶血反應(yīng)：由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）進(jìn)行特異性的結(jié)合，在電解質(zhì)存在時(shí)能發(fā)生凝集，若再有補(bǔ)體參與，紅血球則被溶解。第14頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆昭a(bǔ)體測(cè)定方法加深了解補(bǔ)體的作用和激活條件第15頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天材料與試劑試劑1.抗原：2%綿羊紅細(xì)胞2.抗體：溶血素3.補(bǔ)體：實(shí)驗(yàn)室常以健康豚鼠血清作為補(bǔ)體材料:小試管，生理鹽水，水浴箱第16頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)方法取試管4支，按下表加入各物試管號(hào)溶血素補(bǔ)體2%SRBC生理鹽水結(jié)果10.50.50.50.520.5-0.51.03-0.50.51.040.50.5（滅活）0.50.5第17頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)方法將上述試管放在37℃水浴箱內(nèi)30分鐘觀察有無(wú)溶血現(xiàn)象。將不溶血試管離心，3000rpm，5min，使紅細(xì)胞沉淀。將2、3號(hào)管上清液分別移入5、6管，按下表加入試劑第18頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)方法試管號(hào)內(nèi)容物溶血素補(bǔ)體2%SRBC生理鹽水結(jié)果2管2沉淀物-0.5-2.53管3沉淀物0.5--2.54管4沉淀物-0.5-2.55管2上清液-0.50.5-6管3上清液0.5-0.5-將上述5支試管放入37℃水浴箱內(nèi)30min觀察有無(wú)溶血現(xiàn)象，并解釋原因第19頁(yè)