蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列分析

關(guān)于蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列分析引言氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子量在75～200Da之間，其化學(xué)通式為：在生物體內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是L型，僅在少數(shù)微生物來(lái)源的多肽中出現(xiàn)D型氨基酸。第2頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)和多肽是由20種氨基酸按照一定的順序通過(guò)肽鍵連接成一長(zhǎng)鏈，然后通過(guò)鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進(jìn)行折疊卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨(dú)特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。因此，分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列是進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部分。引言第3頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)測(cè)序的研究歷史1947采用部分水解的方法試圖測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列Consden等利用色譜技術(shù)成功測(cè)定了短桿菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)（由51個(gè)氨基酸殘基組成）Spackman、Stein、Moore制造了自動(dòng)化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段Edman

推出第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀195819551940年前1967第4頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天引言牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)第5頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天引言第6頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的基本流程1.拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈;2.鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基;3.用兩種或幾種不同的斷裂方法將多肽鏈裂解成較小的片段;4.對(duì)各肽段的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)序;5.重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu);6.確定半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵的位置；7.酰胺基位置的確定。引言第7頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)前的準(zhǔn)備工作1.樣品純度必須>97%以上；聚丙烯酰胺凝膠電泳要求一條帶2.測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量；SDS，凝膠過(guò)濾法，沉降系數(shù)法3.測(cè)定蛋白質(zhì)多肽鏈種類(lèi)和數(shù)目；種類(lèi)：SDS

數(shù)目：N末端氨基酸殘基摩爾數(shù)/蛋白質(zhì)摩爾數(shù)4.測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)；引言第8頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)氨基酸組成分析章節(jié)第二節(jié)蛋白質(zhì)的末端測(cè)定第三節(jié)

亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離第四節(jié)

肽段的氨基酸順序測(cè)定第五節(jié)

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重建第9頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

氨基酸組成分析第10頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、特殊氨基酸的保護(hù)三、衍生方法及原理第一節(jié)氨基酸組成分析四、氨基酸定性和定量分析一、蛋白質(zhì)或多肽的水解方法五、測(cè)定氨基酸組成的實(shí)驗(yàn)步驟第11頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天氨基酸組成分析的目的

現(xiàn)代分離提純技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)操作微量化，但也給定量帶來(lái)了困難，一般很難通過(guò)常規(guī)的稱(chēng)量或測(cè)蛋白溶液在280nm的光吸收值來(lái)準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)，所以如果在蛋白質(zhì)酶解或測(cè)序前，取蛋白質(zhì)樣品的一部分進(jìn)行氨基酸組成分析，根據(jù)結(jié)果便可以推算出蛋白量的可靠值。第12頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天另外，在蛋白質(zhì)測(cè)序中有時(shí)遇到測(cè)不出結(jié)果的情況，一種可能是蛋白質(zhì)的N端封閉，另一種可能則是樣品本身不是蛋白質(zhì)或絕大部分是非蛋白質(zhì)物質(zhì)，解決這個(gè)問(wèn)題的很好途徑便是做一個(gè)氨基酸組成分析以確定樣品的成分。除了蛋白質(zhì)研究和重組蛋白需要測(cè)定氨基酸組成外，醫(yī)學(xué)上也需要測(cè)定血液或各種體液中的游離氨基酸。第13頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1水解在一定溫度、酸度等條件下，蛋白質(zhì)或多肽的肽鍵斷裂，水解成游離氨基酸。3色譜利用高效液相色譜對(duì)這些氨基酸進(jìn)行定性和定量色譜分析。2衍生在游離氨基酸殘基上衍生一個(gè)生色基團(tuán)目前蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸組成分析主要包括3個(gè)步驟，即：最終獲得蛋白質(zhì)或多肽中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)或摩爾比。氨基酸組成分析的步驟第14頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)或多肽的水解方法水解是蛋白質(zhì)氨基酸組成分析的第一步，作用是破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，得到游離的氨基酸，用于之后的定性定量分析。這是極其重要的一步，因?yàn)樗赓|(zhì)量的好壞將直接影響到最終分析結(jié)果的正確與否。第15頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

雖然多肽的氨基酸組成分析已向更靈敏、更精確、更快速以及自動(dòng)化方向發(fā)展和改進(jìn)，但還沒(méi)有一種單獨(dú)適用于所有殘基的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出現(xiàn)，很多因素如溫度、時(shí)間、水解試劑、添加劑、水解方法等對(duì)水解的完全程度均有影響。下面主要對(duì)一些常用的水解方法作簡(jiǎn)要介紹。第16頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、酸性水解酸性水解是采用較多的一種水解方法，其中HCl是最通用的水解劑。條件：6mol/LHCI、真空、110℃，水解時(shí)間為20～24h。即可用于液相水解模式也可用于氣相水解模式。損失：在該條件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則被完全破壞，半胱氨酸不能從樣品中直接測(cè)定，酪氨酸部分被水解液中痕量雜質(zhì)所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解，損失分別為10%和5%。第17頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天相關(guān)措施：對(duì)某些氨基酸的破壞率，需要用不同水解時(shí)間測(cè)定這些氨基酸的含量，然后外推到水解時(shí)間為0時(shí)，算得的氨基酸含量，即代表了真正數(shù)值。有些脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵，如Ile-Ile、Val-Val、Ile-Val等之間的肽鍵難于裂解，可以通過(guò)延長(zhǎng)水解時(shí)間如水解92h甚至120h來(lái)解決。但是長(zhǎng)時(shí)間的水解，會(huì)使較敏感的氨基酸殘基的損失更大。半胱氨酸和甲硫氨酸往往先將蛋白質(zhì)用過(guò)甲酸氧化后再水解，相應(yīng)得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。

第18頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、堿性水解堿性水解一般選用NaOH和KOH作為水解劑。例如將水解樣品加入5mol/LNaOH中，充氮?dú)夂筇畛涔埽?10℃水解22h。該水解方法是HCl水解的互補(bǔ)法。因?yàn)閴A水解時(shí)，多數(shù)氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破壞，其它的氨基酸外消旋化，僅色氨酸是穩(wěn)定的。所以此法僅限于測(cè)定色氨酸的含量。第19頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、酶水解用一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對(duì)化學(xué)水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)是水解過(guò)程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。因?yàn)槊杆鈼l件溫和，對(duì)天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無(wú)破壞作用。缺點(diǎn)是反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，水解的產(chǎn)物為較小的肽段，水解不完全。另外，因?yàn)槊副旧硪彩堑鞍踪|(zhì)，對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果可能會(huì)有干擾。第20頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天常見(jiàn)蛋白水解酶及其作用位點(diǎn)第21頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、微波輻射能水解微波是一種高頻電磁波，其能量傳遞是通過(guò)分子的極化，而水分子的極化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能導(dǎo)致完全水解的時(shí)間大大縮短。在微波輔助酸水解和微波輔助酶水解中，水解時(shí)間可從過(guò)去的幾十小時(shí)縮短到幾十分鐘。因此，微波輔助蛋白質(zhì)水解技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了氨基酸組成分析的效率。第22頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、膜上蛋白質(zhì)印跡樣品的水解（原位分析）如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法(如SDS)分離，很難從凝膠中洗脫下來(lái)，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，然后在PVDF膜上直接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱(chēng)之為原位(insitu)分析。可將水解指管放入水解反應(yīng)器中，在反應(yīng)器底部加入200ul含7％巰基乙酸的6mol/L鹽酸，110℃真空水解24h，水解結(jié)束后用200ul含30％甲醇的0.1mol/L鹽酸反復(fù)三次將氨基酸從PVDF膜中抽提出來(lái)，以便進(jìn)行下一步的分析。第23頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天總之，蛋白質(zhì)水解階段所采用的方法不同，會(huì)對(duì)氨基酸組成分析產(chǎn)生重要影響。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)、不同的研究目的、以及樣品量的多少，應(yīng)采取不同的水解方法。第24頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、特殊氨基酸的保護(hù)不同水解條件下，各種氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半胱氨酸可能遭水解破壞，導(dǎo)致無(wú)法正確測(cè)定其含量。因此水解過(guò)程中，需要考慮對(duì)特殊氨基酸的保護(hù)。第25頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天色氨酸的保護(hù)水解酸中加添加劑：例如加入巰基乙酸和β-巰基乙醇，可使色氨酸的回收可達(dá)80％。有機(jī)酸：3mol／L疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水解時(shí)對(duì)色氨酸有一定的保護(hù)作用。酶：利用蛋白酶作為水解劑，條件溫和，對(duì)天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均無(wú)破壞作用。堿：用氫氧化鈉和氫氧化鋇代替酸水解，可保護(hù)色氨酸不被破壞。第26頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天光譜法：分光光度法：應(yīng)用較早，在蛋白質(zhì)分子中，如不含胱氨酸和其他有干擾的發(fā)色基團(tuán)的氨基酸，根據(jù)其在6mol/L鹽酸胍的中性溶液中的紫外吸收，測(cè)定色氨酸和酪氨酸的含量，此經(jīng)驗(yàn)公式只適用于色氨酸對(duì)酪氨酸的比值為0.2~1時(shí)的情況。二階微分光譜法：常被用來(lái)確定蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量，計(jì)算公式復(fù)雜，HewlettPackard公司推出的DAD檢測(cè)器配合其化學(xué)工作站軟件，能較方便地在線檢測(cè)并定量肽段中的色氨酸。第27頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天半胱氨酸的保護(hù)：還原烷化法：產(chǎn)生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化試劑包括4-乙烯吡啶和碘代乙酸。缺點(diǎn)：為了確保試劑接近巰基，還原和氧化通常在變性劑存在下進(jìn)行，多余試劑和變性劑要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成樣品的損失。第28頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天氧化反應(yīng)：過(guò)甲酸氧化反應(yīng)被用來(lái)轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸成為半胱磺酸再進(jìn)行測(cè)定。缺點(diǎn)：會(huì)影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸會(huì)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸砜，酪氨酸會(huì)降解。必須準(zhǔn)備能分析兩次的樣品量．一次提供半胱氨酸數(shù)據(jù)，另一次則提供其他氨基酸的組成數(shù)據(jù)。第29頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、衍生方法及原理衍生是將氨基酸衍生為有利于測(cè)定或分離的化合物。大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。從衍生角度看，氨基酸分析可以分為柱后反應(yīng)法和柱前衍生法兩大類(lèi)。第30頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天柱后反應(yīng)法將游離氨基酸經(jīng)過(guò)色譜柱分離后，各種氨基酸再與顯色劑(茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛)作用。優(yōu)點(diǎn)：比較穩(wěn)定，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，容易定量和自動(dòng)化操作。缺點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度不高，分析時(shí)間長(zhǎng)(蛋白質(zhì)水解液需1h而某些生理樣品則需4h以上)。第31頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天柱前衍生法將氨基酸和化學(xué)偶聯(lián)試劑先反應(yīng)生成氨基酸的衍生物，然后再用色譜柱將各種衍生物分離，直接檢測(cè)衍生物的光吸收或熒光發(fā)射。優(yōu)點(diǎn)：此法可檢測(cè)OPA-（鄰苯二甲醛），PTC-，PTH-，DABS-，Dansyl-和DABTH-氨基酸，分析靈敏度高，可利用HPLC進(jìn)行氨基酸分析。缺點(diǎn)：有的衍生物不穩(wěn)定，衍生試劑可能干擾氨基酸檢測(cè)。第32頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天柱后反應(yīng)法VS柱前衍生法第33頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天幾種常見(jiàn)的氨基酸分析方法：1、茚三酮反應(yīng)2、熒光胺法3、鄰苯二甲醛(OPA)法4、PTC-AA分析法5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法第34頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、茚三酮反應(yīng)α-氨基酸與水合茚三酮一起在水溶液中加熱，除脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它氨基酸都產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)。此反應(yīng)十分靈敏，根據(jù)反應(yīng)所生成的藍(lán)紫色的深淺，在570nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色就可測(cè)定樣品中氨基酸的含量。第35頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、柱后熒光胺法熒光胺能在室溫下迅速和一級(jí)胺發(fā)生反應(yīng)，其熒光產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)475nm。熒光胺與氨反應(yīng)的靈敏度比茚三酮與氨反應(yīng)的靈敏度大約提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。第36頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、鄰苯二甲醛(OPA)法OPA最早是被作為柱后衍生試劑而引進(jìn)的，后來(lái)也逐漸應(yīng)用于柱前反應(yīng)中。OPA能在還原劑巰基乙醇存在下和一級(jí)胺產(chǎn)生具有很強(qiáng)熒光的異吲哚衍生物，該反應(yīng)在室溫下1min即可完成。第37頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、PTC-AA分析法屬柱前衍生法，源于Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。異硫氰酸苯酯(PITC)能在堿性條件下和氨基酸反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰（PTC）-AA，能在254nm檢出。此法分析靈敏度和熒光胺、OPA的熒光法相同。第38頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能與所有氨基酸柱前反應(yīng)形成高穩(wěn)定性的帶有熒光的DNS-氨基酸。但反應(yīng)耗時(shí)。第39頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法

靈敏度是Dansyl-Cl法的1/5，反應(yīng)產(chǎn)生有色衍生物，能方便地在254nm和425nm處用紫外檢測(cè)。有報(bào)道用DABITC代替Dabsyl-Cl，反應(yīng)產(chǎn)生DABTH-AA，在酸性環(huán)境中顯紅色，易在254nm，269nm，436nm檢測(cè)。第40頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第41頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、氨基酸定性和定量分析

氨基酸的定性和定量分析一般采用紙層析、薄層層析、離子交換柱層析等方法。采用HPLC儀和氨基酸自動(dòng)分析儀更好。隨著儀器的不斷改進(jìn)，一個(gè)樣品的測(cè)定僅需20min即可完成。第42頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天單向紙層析第43頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙向紙層析第44頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天薄層層析第45頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換層析第46頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）第47頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)中氨基酸的組成一般用每摩爾蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的摩爾數(shù)表示，或每100g蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)表示。所以只有知道蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，才能推出它的氨基酸組成。第48頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：血小板衍生生長(zhǎng)因子的氨基酸組成第49頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、測(cè)定氨基酸組成的實(shí)驗(yàn)步驟

目前各大公司如Beckman，HewlettPackard，PerkinE1mer，Waters等都有各自的自動(dòng)進(jìn)樣、氨基酸分析和定量報(bào)告聯(lián)為一體的商品化氨基酸自動(dòng)分析儀出售，下面介紹幾種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定氨基酸組成的方法。第50頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、鄰苯二甲醛(OPA)法實(shí)驗(yàn)操作：稱(chēng)取5mgOPA溶于0.1m1甲醇中，加入50ul巰基乙醇，用0.2mol／LpH9.5的硼酸緩沖液稀釋至1ml。通氮?dú)獠⒈芄獗４?，每隔兩天加?ul巰基乙醇以維持其強(qiáng)度，此OPA反應(yīng)試劑能用2~3周。取10u1標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液(50~100pmol)或樣品水解液，加10ulpH9.5的硼酸緩沖液(內(nèi)含2％SDS和100pmolα-氨基丁酸)，然后加入10u1OPA試劑，混合均勻，反應(yīng)1min后再加入20ul0.1mol/L的KH2PO4中止反應(yīng)，并立即取20ul注入RP-HPLC柱進(jìn)行分析。

第51頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天儀器為Beckman344HPLC儀，反相柱RP-18(250mm×4.6mm)，熒光檢測(cè)器。流動(dòng)相：A50mmol/L乙酸緩沖液pH6.8:甲醇:THF=80:19:1B50mmol/L乙酸緩沖液pH6.8:甲醇＝80:20梯度條件是：5min，10％B;10min，15％B,20min，10％B；25min，15％B；

35min，50％B；50min，90％B;55min，100％B。

第52頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第53頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

用乙醇代替劇毒的乙腈或甲醇作為有機(jī)相來(lái)定量分析氨基酸，靈敏度可達(dá)10pmol。第54頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、PTC-AA實(shí)驗(yàn)操作：氨基酸或樣品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50ul偶聯(lián)試劑(乙醇:三乙胺:水＝7:1:1)中。此溶液在旋轉(zhuǎn)真空干燥后再次溶解于50ul偶聯(lián)試劑中，然后加入2ulPITC(異硫氰酸苯酯)，反應(yīng)混合物在250C下保溫15min，再次旋轉(zhuǎn)真空干燥，真空度(1.3~13Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在適量流動(dòng)相A中，取一部分上柱定量分析。第55頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天儀器為BeckmanGoldSystemHPLC儀，反相柱RP-18(250mm×4.6mm)或PTH-柱，254nm檢測(cè)。流動(dòng)相：

A50mmol/L乙酸鈉，pH6.8B50mmo1／L乙酸鈉，pH6.8:乙腈＝50:50HPLC柱采用水浴夾套40℃恒溫，并用5％流動(dòng)相B平衡。梯度條件是：0min,5%B,5min,5％-15％B,10min,15％B；30min,15％~60％B,40min,60~5％B流速是1ml／min。第56頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第57頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、茚三酮法實(shí)驗(yàn)操作：水解后氨基酸樣品溶解于Na-S樣品稀釋液中100u1上樣分析，實(shí)際進(jìn)樣量50ul(100pmol~5nmol，均呈線性)。第58頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天儀器：Beckman6300氨基酸分析儀。流動(dòng)相：

Na-E0.0min溫度：0.0min48℃Na-D27.80min11.8min65℃Na-F39min32.5min77℃Na-R76.00min50min48℃Na-E77.00-90min流速：緩沖液14ml/h

茚三酮7ml/h第59頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第60頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

蛋白質(zhì)的末端測(cè)定第61頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的末端分析的目的:確定其氨基末端殘基及羧基末端殘基了解蛋白質(zhì)分子中肽鏈的組成情況。例如，牛胰島素單體有2個(gè)N-末端和2個(gè)C-末端，是由2條肽鏈通過(guò)二硫鍵相連而成；血紅蛋白分子有4個(gè)N-末端和4個(gè)C-末端，為4個(gè)亞基通過(guò)次級(jí)鍵組成的分子。第62頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

末端分析通常采用專(zhuān)一性化學(xué)試劑與末端氨基或羧基反應(yīng)，然后分解出被作用的末端氨基酸加以測(cè)定。由于與羧基反應(yīng)的活化能相當(dāng)高，所以用于與羧基反應(yīng)的專(zhuān)一性試劑比較少，而N端測(cè)定的方法較多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有應(yīng)用。下面介紹常用的N-末端和C-末端測(cè)定的方法，以及封閉N-末端的測(cè)定。第63頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、C-末端的測(cè)定三、封閉N-末端的測(cè)定第二節(jié)蛋白質(zhì)的末端測(cè)定一、N-末端的測(cè)定第64頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、N-末端的測(cè)定

N末端測(cè)定方法比C末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的方法有：1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）3、異硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法5、氨肽酶法第65頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）二硝基氟苯在弱堿性條件下，與肽鏈的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽鏈（DNP-肽），經(jīng)酸水解后，N端殘基成為二硝基苯基（DNP）-氨基酸，可用有機(jī)溶劑（如乙醚）抽提，再進(jìn)行紙層析或薄層層析后，根據(jù)層析斑點(diǎn)的位置作定性鑒定。第66頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

FDNB不僅與N-末端的α-氨基起反應(yīng)，也與側(cè)鏈上的ε-氨基、巰基、酚羥基和咪唑基反應(yīng)，但水解產(chǎn)物極性較強(qiáng)，不被乙醚抽提，而不干擾末端的測(cè)定。當(dāng)N-端殘基為脯氨酸或羥脯氨酸時(shí)，因DNP-脯氨酸或DNP-羥脯氨酸在鹽酸水解條件下極不穩(wěn)定，如DNP-脯氨酸易分解成脯氨酸以及δ-氯-α-DNP-氨基戊酸和α-氯-δ-DNP氨基戊酸，所以回收率甚低，不能進(jìn)行測(cè)定。

第67頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）熒光劑DNS-Cl可與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽，經(jīng)酸水解，N-末端殘基形成DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法鑒定。DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)位置確定N端氨基酸。第68頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

DNS-脯氨酸經(jīng)6MHCl于110℃水解過(guò)夜有70%被破壞。色氨酸及其DNS衍生物在鹽酸水解時(shí)完全被破壞，可改用巰基乙烷磺酸在真空下水解，并用乙酸乙酯抽提非極性得DNS-氨基酸加以鑒定。第69頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天賴(lài)氨酸的ε-氨基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及酪氨酸的羥基也能與DNS-Cl進(jìn)行反應(yīng)。但半胱氨酸和組氨酸側(cè)鏈衍生物在酸水解時(shí)并不穩(wěn)定。當(dāng)N-末端為組氨酸、精氨酸或半胱氨酸（S-羧甲基半胱氨酸形式或磺酸形式）時(shí)，對(duì)其測(cè)定也受到一定限制。當(dāng)N-末端氨基酸為谷氨酸或谷氨酰胺、天冬氨酸或天冬酰胺時(shí)，因有高溫水解過(guò)程，對(duì)它們不能區(qū)別。第70頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、異硫氰酸苯酯法在弱堿中，異硫氰酸苯酯（PITC）與N端氨基偶聯(lián)生成苯基硫甲酰衍生物（PTC-肽）。在酸性溶液中，PTC-肽經(jīng)環(huán)化裂解生成PTC-氨基酸和N端少個(gè)氨基酸的剩余多肽。由于PTC-氨基酸不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)化成苯基乙內(nèi)酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。生成PTH-氨基酸非常穩(wěn)定，在268nm處有強(qiáng)吸收峰。第71頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

噻咪啉酮衍生物經(jīng)氯乙烯抽提后，留下的肽鏈再可作下一次的循環(huán)，分析次一個(gè)氨基酸殘基。因而此法也稱(chēng)為Edman順序降解，可用于蛋白質(zhì)或多肽的N端順序測(cè)定，一般可測(cè)定末端30個(gè)左右的殘基，是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。

第72頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、DABITC法

DABITC（4-N,N-對(duì)甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯）能與N端氨基反應(yīng)生成DABTH-氨基酸，經(jīng)層析分離后，用鹽酸氣熏即可出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，很容易鑒定。第73頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、氨肽酶法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。但由于酶的特異性和對(duì)各種氨基酸水解速度不用，結(jié)果往往不易判斷，在實(shí)際應(yīng)用中容易導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。第74頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、C末端的測(cè)定C末端測(cè)定方法較少，而且較N末端分析誤差大?？刹捎玫姆椒ㄓ校?、羧肽酶法2、硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法）3、肼解法第75頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、羧肽酶法羧肽酶是一種肽鏈外切酶，能從多肽鏈的C端逐個(gè)的水解氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C末端殘基順序。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，由于羧肽酶對(duì)不同的C末端氨基酸作用的速度不同，而且反應(yīng)是連續(xù)的，不能停在某一步上，因此給正確判斷氨基酸的順序造成了一定的困難。第76頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天4種常用羧肽酶：羧肽酶來(lái)源專(zhuān)一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當(dāng)廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸第77頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法）

硼氫化鋰可與C末端氨基反應(yīng)生成相應(yīng)的α-氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用層析法分離、鑒定。第78頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、肼解法當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和無(wú)水肼在100℃反應(yīng)5～10h，肼可斷裂所有的肽鍵，使所有氨基酸殘基形成肼的衍生物——氨基酸酰肼，可與苯甲醛作用形成不溶的二亞芐基衍生物而除去，唯有C末端氨基酸以游離的形式存在于上清液中。第79頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

肼解法不適宜于C端為胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的測(cè)定。肽鏈中的丙氨酸、絲氨酸以及甘氨酸殘基形成的酰肼化合物不穩(wěn)定，在水溶液中容易轉(zhuǎn)化為原來(lái)的氨基酸而干擾結(jié)果。第80頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、封閉N-末端的測(cè)定

有些蛋白質(zhì)的肽鏈沒(méi)有游離的氨基端，較多的情況是氨基端因受到乙?；蚬劝彼釟埢陨憝h(huán)化為焦谷氨酸殘基而被封閉。此時(shí)我們可采用相應(yīng)方法對(duì)封閉N-末端進(jìn)行測(cè)定。第81頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．乙?；疦-末端肼解條件下，N端的乙?；纬梢阴ｋ隆Ｈ缓?，使其與DNS-Cl作用，形成N-乙酰-N’-丹磺酰肼，經(jīng)乙醚抽提出來(lái)后，可應(yīng)用薄層層析等方法鑒定。由于乙?；c氨基形成的酰胺鍵比較穩(wěn)定，在部分酸水解條件（如pH2，105℃90min）下有可能產(chǎn)生乙酰基氨基酸，與已知標(biāo)準(zhǔn)化合物對(duì)照，也可以應(yīng)用層析等方法對(duì)其加以鑒定。第82頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．吡咯烷酮羧酸末端

牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，從而使剩下的有自由氨基端的肽鏈可以用Edman方法遞減分析。第83頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3．甲酰基末端

甲?；Ｒ约柞＜琢虬彼岬男问酱嬖谟谠梭w系的初生肽鏈的端部。甲酰氨鍵比起一般肽鍵要不穩(wěn)定得多，所以弱酸條件（如0.5MHCl的甲醇溶液）下在室溫處理48小時(shí)，可以使甲?；庀聛?lái)。然后再可仿照乙?；臏y(cè)定方法加以鑒定。第84頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離第85頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

從蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，可以知道蛋白質(zhì)是否由多亞基組成。若末端分析只有單一的結(jié)果，說(shuō)明分子由相同亞基組成，無(wú)需將亞基拆開(kāi)、分離。反之，分子若有兩種以上不同亞基組成，首先要將不同亞基之間的連接拆開(kāi)，并進(jìn)行分離提純。提純后的亞基肽鏈一般都是相對(duì)分子質(zhì)量也比較大，需要將大的肽鏈降解成小的肽段，并將肽段提純，然后才能正式開(kāi)始順序測(cè)定工作。

第86頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、肽鏈的部分降解三、肽段的分離提純第三節(jié)亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離一、亞基拆離和二硫鍵的斷裂第87頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、亞基拆離和二硫鍵斷裂

蛋白質(zhì)由一條以上的肽鏈組成時(shí)，肽鏈間的結(jié)合可能是靠非共價(jià)鍵結(jié)合，也可能是靠共價(jià)鍵結(jié)合。在進(jìn)行肽鏈順序分析時(shí)，首先要將它們分離開(kāi)來(lái)。若多亞基間以非共價(jià)鍵連接，在溫和條件下即可以拆離亞基，如改變?nèi)芤簆H，將pH降低到3～4或升高到9～10；或者加入變性劑，如8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍等。例如，血紅蛋白經(jīng)8mol/L脲處理后，α及β鏈可以得到分離；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2mol/L巰基乙醇及1%SDS溶液中保溫1小時(shí)，大小亞基便相互分開(kāi)。拆離后的亞基可以用凝膠過(guò)濾方法進(jìn)行分離。第88頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天拆分靠共價(jià)鍵結(jié)合的因比較牢固須用特殊的化學(xué)作用使其破壞。最常見(jiàn)的是半胱氨酸殘基經(jīng)氧化作用而形成胱氨酸殘基，即二硫鍵結(jié)構(gòu)。第89頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．過(guò)甲酸氧化法優(yōu)點(diǎn)：能將巰基（-SH）和二硫鍵（-S-S-同時(shí)氧化成磺基，生成的磺酸基很穩(wěn)定，肽鏈不再重新形成二硫鍵，便于肽鏈分離。缺點(diǎn)：氧化過(guò)程中，同時(shí)將蛋磺酸的側(cè)鏈氧化成亞砜，色氨酸的側(cè)鏈也遭破壞。第90頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．還原法一般可使用過(guò)量巰基化合物，如β-巰基乙醇。在室溫或pH8～9條件下放置數(shù)小時(shí)，即可使二硫鍵還原成巰基。加入8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性。在這種情況下，還原劑才能有效地作用于暴露的二硫鍵。二硫鍵還原后，需要用巰基保護(hù)試劑，如碘乙酸，以防其重新被氧化。第91頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、肽鏈的部分降解

由于氨基酸順序測(cè)定多數(shù)采用Edman降解法，它一次能分析肽鏈長(zhǎng)度約10余個(gè)氨基酸殘基，所以分離得到的單鏈如果太長(zhǎng)，須將長(zhǎng)的肽鏈斷裂成易分析的較短肽鏈。肽鏈部分降解的方法要求選擇性強(qiáng)、裂解點(diǎn)少、反應(yīng)率高，一般采用化學(xué)裂解和酶解法兩種。第92頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．化學(xué)裂解法

溴化氰（CNBr）與肽鏈中蛋氨酸側(cè)鏈的硫醚基發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)化的溴化亞氨內(nèi)酯，此產(chǎn)物水解后，產(chǎn)生高絲氨酸內(nèi)酯，使蛋氨酸羧基端的肽鍵斷裂。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高（可達(dá)85%）、專(zhuān)一性強(qiáng)，故實(shí)際應(yīng)用較多。第93頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．酶解法酶解法相對(duì)化學(xué)裂解法而言，有許多優(yōu)點(diǎn)，如專(zhuān)一性強(qiáng)、裂解條件溫和、副反應(yīng)少等，再則蛋白水解酶對(duì)肽鏈的水解率也比較高，而且不同的蛋白水解酶對(duì)不同氨基酸形成的肽鍵水解專(zhuān)一性不同。因此，酶解法被廣泛使用。第94頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天幾種常用蛋白水解酶的作用位點(diǎn)第95頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．羥胺裂解法羥胺（NH2OH）在堿性條件下（pH9.0）能專(zhuān)一性裂解-Asn-Gly-間的肽鍵，也能部分裂解-Asn-Leu-或-Asn-Ala-間的肽鍵；在酸性條件可以斷裂-Asp-Pro-間的肽鍵，產(chǎn)率可達(dá)80%。

第96頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．部分酸水解一般認(rèn)為酸水解沒(méi)有什么專(zhuān)一性而被忽視，后來(lái)發(fā)現(xiàn)部分酸水解還是有一定的專(zhuān)一性。在稀酸的條件下，也即在高濃度胍的甲酸中（pH2.5），可裂解-Asp-Pro-間的肽鍵，產(chǎn)率高達(dá)80%～90%。在濃酸條件下，含羥基氨基酸氨基端肽鍵容易斷裂。但是終究部分酸水解的專(zhuān)一性差，副反應(yīng)多，此法比較難掌握。第97頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、肽段的分離提純

肽鏈經(jīng)部分裂解得到肽片段必須分離提純，才能進(jìn)一步測(cè)定其氨基酸順序。先采用凝膠過(guò)濾，得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的肽片段組分，同時(shí)也脫去了樣品中的鹽類(lèi)。然后，肽片段組分可用離子交換層析進(jìn)一步提純，也可應(yīng)用雙相高壓紙電泳和層析相結(jié)合的方法，HPLC或FPLC具有更高的分辨率。第98頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)

肽段的氨基酸順序測(cè)定第99頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天目前，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測(cè)定有二個(gè)關(guān)鍵步驟，即：①氨基酸殘基一個(gè)一個(gè)依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來(lái)?？刹捎没瘜W(xué)法或酶法進(jìn)行裂解。可以從蛋白質(zhì)和多肽的N端進(jìn)行裂解，也可以從C端進(jìn)行分析。②正確鑒定每次切割下來(lái)的氨基酸殘基。利用高效液相色譜，對(duì)帶有生色基團(tuán)的氨基酸殘基進(jìn)行分離分析。第100頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、N端蛋白質(zhì)序列儀三、影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素第四節(jié)肽段的氨基酸順序測(cè)定四、N端測(cè)序前樣品處理一、N端測(cè)序原理五、C端測(cè)序原理六、C端蛋白質(zhì)序列儀七、C端測(cè)序樣品前處理八、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素第101頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、N端測(cè)序原理

至今應(yīng)用最廣的N端順序測(cè)定法大多仍以Edman降解原理為基礎(chǔ)。第102頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

偶聯(lián)：蛋白質(zhì)和多肽的自由α-氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，與其緊挨的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。

裂解：在無(wú)水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個(gè)殘基，得到ATZ-氨基酸。緊挨的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的α-氨基，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

轉(zhuǎn)化：ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，三氟乙酸水溶液（25%）條件下可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。

PTH-氨基酸的鑒定：可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。第103頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、N端蛋白質(zhì)序列儀自70年代初自動(dòng)序列儀誕生以來(lái)，經(jīng)過(guò)了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速，下面就其中幾種代表性的儀器作一簡(jiǎn)單介紹。第104頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀這是最初的自動(dòng)化儀器。整個(gè)儀器的“核心”部分是一個(gè)反應(yīng)杯，它由一個(gè)馬達(dá)帶動(dòng)并有調(diào)速控制。蛋白質(zhì)或多肽樣品經(jīng)溶解后，通過(guò)一根導(dǎo)管注入反應(yīng)杯中，樣品隨著旋轉(zhuǎn)的離心力被均勻地涂在杯壁上，形成一層薄膜，其厚薄可由轉(zhuǎn)速控制。反應(yīng)的試劑和溶劑分別通過(guò)導(dǎo)管進(jìn)入反應(yīng)杯，與杯內(nèi)薄層上的樣品的N端自由氨基進(jìn)行Edman反應(yīng)；降解下來(lái)的ATZ氨基酸衍生物通過(guò)另一導(dǎo)管引出并收集，再將ATZ氨基酸轉(zhuǎn)換成PTH氨基酸后進(jìn)行鑒定，依次循環(huán)分析。此儀器由于消耗的樣品量多，目前在蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室已很少作用。第105頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．固相序列分析儀由于一些小肽或疏水性多肽，不易吸附在一般支持物上(如旋轉(zhuǎn)杯)，只得將它們共價(jià)固定在惰性載體后進(jìn)行Edman化學(xué)降解反應(yīng)。固相測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)是樣品共價(jià)結(jié)合后，不會(huì)在有機(jī)溶劑洗滌，抽提等過(guò)程中丟失，因而可以增加循環(huán)次數(shù)。其缺點(diǎn)是共價(jià)結(jié)合不外乎通過(guò)氨基或羧基與載體上的活性基團(tuán)作用，蛋白質(zhì)和多肽中的谷氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸等含有除α-氨基或α-羧基以外氨基或羧基的氨基酸殘基將結(jié)合在載體上，不能正確確定。第106頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．氣相序列儀

用彈筒型玻璃反應(yīng)室(內(nèi)部體積約0.05ml）代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種四級(jí)銨鹽聚合物“polybrene”固定樣品，Edamn降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式輸送，其它試劑以流動(dòng)或液相脈沖方式輸送。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需10~100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的1／10，降低了費(fèi)用；縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。第107頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素

在測(cè)序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過(guò)十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。這是由于Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，在其偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。第108頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天例如三氟乙酸除起裂解作用外，可能與絲氨酸Ser和蘇氨酸Thr上的羥基反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和Thr的N端α-氨基，導(dǎo)致Ser和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低。絲氨酸和蘇氨酸的PTH-衍生物也會(huì)部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率的降低。偶聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。第109頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、N端測(cè)序前樣品處理1.純度鑒定宜采用多種互補(bǔ)有效的手段鑒定樣品的純度，如SDS、反相HPLC、毛細(xì)管電泳、陰離子或陽(yáng)離子的FPLC等。

2.脫鹽可采用多種有效的脫鹽方法如反相HPLC、凝膠過(guò)濾、透析、超濾等，但需注意在進(jìn)行脫鹽過(guò)程中除需考慮是否除鹽完全外，所用試劑、儀器乃至操作規(guī)范也必須是測(cè)序級(jí)的，應(yīng)盡量避免引入新的雜質(zhì)。3.疏基修飾4.去除N端封閉的基團(tuán)第110頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、C端測(cè)序原理

雖然建立在Edman化學(xué)法上的自動(dòng)化N端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問(wèn)題需借助C端序列分析來(lái)解決。C端測(cè)序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析以及DNA探針的設(shè)計(jì)。第111頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

原理

基于與N端Edman降解類(lèi)似的原理，C端分析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的α-羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的C末端衍生物被切割下來(lái)，通過(guò)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。一個(gè)完整的C端序列分析包括以下幾個(gè)步驟。第112頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)活化蛋白質(zhì)和多肽C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進(jìn)一步環(huán)化成聚噁唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐則難以成環(huán)。C末端的聚噁唑酮在四丁基銨硫氰酸鹽的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(TH)。第113頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)酰胺化保護(hù)側(cè)鏈羧基側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與哌叮硫氰酸鹽（piperidinethiocyanate）進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈。第114頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)烷基化

由于C末端環(huán)化成的TH衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因此產(chǎn)率不高。用Bromomethylna－phthylene選擇性地烷基化修飾硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高.。第115頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

(4)修飾Thr和Ser的羥基

蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會(huì)干擾測(cè)序，因此需要修飾。在活化過(guò)程中，乙酸酐也會(huì)與羥基反應(yīng)將其乙?；磻?yīng)不完全，在N-甲基咪唑（N-methlimidazole，NMI）和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羥基基本被乙酰化。第116頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天

(5)裂解和衍生

C末端的ATH衍生物在酸性條件下與硫氰酸鹽反應(yīng)而被裂解生成ATH-氨基酸，新的C末端自動(dòng)形成TH，而不必重新活化。因此，整個(gè)測(cè)序過(guò)程只需在開(kāi)始時(shí)對(duì)C端進(jìn)行一次性活化，并修飾Asp和Glu側(cè)鏈羧基，以及Thr和Ser的羥基。第117頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、C端蛋白質(zhì)序列儀C端序列儀一般由N端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不同之處主要在于:(1)反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵塞管道。(2)在C端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來(lái)的ATH-AA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析。而在N端測(cè)序儀中，ATZ-AA需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。第118頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期天第119頁(yè),共130頁(yè)，2024年2月25日，星期