酶促反應(yīng)動力學(xué)堿性磷酸酶值測定

關(guān)于酶促反應(yīng)動力學(xué)堿性磷酸酶值測定

影響酶促反應(yīng)速度的因素酶促反應(yīng)速度CFDEA底物濃度酶濃度pH值抑制劑激活劑B溫度第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天酶濃度對反應(yīng)速度的影響正比例關(guān)系底物濃度>酶濃度酶被底物飽和第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天溫度對反應(yīng)速度的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天pH對反應(yīng)速度的影響在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天激活劑對反應(yīng)速度的影響必需激活劑，大多為金屬離子，Mg2＋，K＋，Mn2＋，等酶的激活劑非必需激活劑第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶活性降低或消失。抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心或活性中心以外的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活。不可逆性抑制作用可逆性抑制作用抑制劑對反應(yīng)速度的影響第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天競爭性非競爭性反競爭性Km,Vmax降低競爭性非競爭性反競爭性Vmax降低競爭性非競爭性反競爭性Km增大可逆性抑制作用第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響底物濃度的增高高低反應(yīng)速度和底物濃度成正比關(guān)系酶活性中心被底物飽和反應(yīng)速度增幅下降第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)酶促反應(yīng)速率一般在規(guī)定反應(yīng)條件下，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來表示。反應(yīng)速率取其初速率，即底物的消耗量很小(≤5%)時(shí)的反應(yīng)速率。底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度。研究前提第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天矩形雙曲線

第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天Km

即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。米－曼氏方程式第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天米氏常數(shù)Km的意義不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。

第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

Vmax定義：Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。意義：Vmax=K3[E]如果酶的總濃度已知，可從Vmax計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnovernumber)，即動力學(xué)常數(shù)K3。第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天米氏常數(shù)的求法1V=KmVmax×[S]11+Vmax

V表示酶促反應(yīng)速度

Vmax表示酶促反應(yīng)最大速度[S]表示底物濃度

Km表示米氏常數(shù)第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天雙倒數(shù)作圖法第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天底物濃度對酶活性的影響——堿性磷酸酶Km值的測定第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)動力學(xué)中的一個(gè)相當(dāng)重要的常數(shù)，通過實(shí)驗(yàn)，可理解并掌握利用實(shí)驗(yàn)求出Km的方法。第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理磷酸苯二鈉堿性磷酸酶H2OpH=10.0，37℃酚Na2HPO4酚試劑（磷鉬鎢酸）OH－藍(lán)色化合物650nm吸光度表示不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速度。以吸光度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖法求出Km值。第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天1．酚試劑2．2.5mmol／L磷酸苯二鈉基質(zhì)液3．堿性緩沖液(pH-10.0)4．堿性磷酸酶液試劑第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天試劑(ml)123456782.5mM磷酸苯二鈉0.20.30.40.50.60.81.01.0蒸餾水0.80.70.60.50.40.2--堿性緩沖液1.01.01.01.01.01.01.01.0混勻后，370C水浴5min堿性磷酸酶液0.10.10.10.10.10.10.1-混勻后，370C水浴15min（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）酚試劑1.01.01.01.01.01.01.01.0堿性磷酸酶液-------0.110％Na2CO33.03.03.03.03.03.03.03.0操作取8支試管，按下表加入試劑?；靹蚝螅?7℃水浴15min，以第8管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在650nm波長處進(jìn)行比色，讀取各管A值。第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天管號A6501/A650[S]1/[S]1234567處理結(jié)果以1/A650對1/[s]按Lineweaver-Burk作圖法作圖，求出堿性磷酸酶的Km第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

在競爭性抑制中，酶不能同時(shí)和底物、抑制劑結(jié)合，即不能形成EIS，I競爭結(jié)合酶活性中心，其動力學(xué)特征是：米氏常數(shù)的表觀值Km增加，酶的最大反應(yīng)速度Vm不變。。

在非競爭性抑制中，抑制劑、底物都能同時(shí)和酶結(jié)合形成EIS，I結(jié)合酶活性中心以外部位，不影響E與S之間的結(jié)合，但是EIS不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其動力學(xué)特征是：Vm降低而Km不變。

在反競爭性抑制中