細胞培養(yǎng)基本知識

關(guān)于細胞培養(yǎng)基本知識細胞室準備室：用于進行培養(yǎng)器皿的清晰、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準備和消毒以及供應(yīng)物品的保藏等.緩沖間：為了減少將外界污染源頭帶入培養(yǎng)室培養(yǎng)室：是專門用于進行細胞培養(yǎng)和各種無菌操作的實驗室。其基本條件是：清潔、無菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮保存罐、離心機、水純化裝置、高壓蒸汽消毒裝置、酶標(biāo)儀過濾除菌裝置、手術(shù)器械、培養(yǎng)器皿、移液器第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天超凈工作臺

利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣通過高效空氣微粒濾層凈化后，徐徐通過工作臺面，在操作區(qū)形成無菌環(huán)境。按氣流方向的不同分為：1.外流式，2.側(cè)流式第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃

，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：

①使用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3升，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天自動雙重純水蒸餾器第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)器皿一次性培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板：一般朔料培養(yǎng)器皿的細胞生長面帶負電荷，有利于大多數(shù)表面帶正電荷的細胞貼壁生長玻璃培養(yǎng)瓶、溶液瓶、移液管第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天常用玻璃器皿清洗浸泡：在5%稀鹽酸溶液中浸泡12h以上，以達到軟化器皿表面所附著物質(zhì)，并中和器皿表面的堿性物質(zhì)。刷洗：用軟毛毛刷將浸泡后的其面在洗滌劑水中反復(fù)刷洗，以除去表面雜質(zhì)。浸酸：利用強氧化作用清除器皿表面可能殘留的有機物,時間在6小時以上最好過夜。沖洗：反復(fù)注滿水、倒空達20次以上。最后用二次水浸洗2～3次，烘干后包裝。第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天清潔液的配制第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天膠塞和塑料用品的清洗先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分鐘，自來水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘，最后分別用自來水和三次水各沖洗3次，烘干備用。第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天過濾除菌裝置1.不銹鋼板式濾器：2.微孔濾膜濾器：有可換膜式濾器和一次性濾器兩大類。第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細胞培養(yǎng)的概念原代培養(yǎng)：就是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換生長器皿。它包括：細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：隨著培養(yǎng)時間的延長、細胞分裂繁殖，細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度逐漸減慢甚至停止，在這種情況下，都需要將培養(yǎng)物分割成小的培養(yǎng)。第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期衰退期第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天體外細胞培養(yǎng)物的生長類型貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞。懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天每代貼附生長細胞的生長過程游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束潛伏期：此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。其機制：接觸抑制、密度依賴性。第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天傳代的方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細胞傳代

離心法傳代：離心（1000r/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2.半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天貼壁生長細胞傳代方法1.

吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS溶液清洗2-3次。2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3.

吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4.

用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5.

吸取1/10—1/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。6.

加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。7.

將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)細胞生長的條件1.細胞的營養(yǎng)需要2.細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓

3無污染

4無毒第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細胞培養(yǎng)用液水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4·H2O1.56gKH2PO40.20g

加水至1000mlPH值調(diào)至7.2-7.4第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天消化液1.胰蛋白酶：主要用的是0.25％胰蛋白酶液，胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，過濾除菌。它作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。用含血清培養(yǎng)液終止其消化作用。2.EDTA：是一種化學(xué)螯合劑，對細胞有一定的解離作用。毒性小、價格便宜、使用方便。3.膠原酶溶液：又稱羧肽酶，有膠原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型及肝細胞專用膠原酶5種，可根據(jù)制備不同組織細胞懸液選擇不同類型的膠原酶第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.天然培養(yǎng)基：有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限，成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染。2.合成培養(yǎng)基：是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標(biāo)準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低。缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天常用血清有：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細胞生長因子，同時也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天抗菌素的使用在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％～95％血清5％～20％HEPES、碳酸氫鈉按培養(yǎng)基的類型添加青、鏈霉素各100單位／毫升第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天RPMI-1640培養(yǎng)基的配制：RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.2gHEPES2.385g青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過濾除菌。調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4加血清（終濃度10％）第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至超低溫條件，并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇是一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物回復(fù)到常溫的過程。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細胞冷到零度以下，細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天慢凍程序標(biāo)準程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當(dāng)溫度達-25℃以下時，5～10℃/min

當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天低溫保護劑的應(yīng)用在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細胞凍存方法1.凍存液配制：含20%血清培養(yǎng)基,10%

DMSO2.取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1×106～5

×106細胞/ml)3.加入1ml細胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細胞名稱和冷凍日期。4.年后，存活率可達80％以上。DMSO液用培養(yǎng)液配好，5.避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞。對人造血干細胞的研究證第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細胞復(fù)蘇方法1.從液氮中取出冷凍管，迅速投入37~38

℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。2.5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。3.低速離心10分鐘。4.去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細胞。第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)細胞活力測定任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。細胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

1.細胞克隆形成率實驗2.臺盼藍法3.四唑鹽（MTT）比色法第37頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.細胞克隆形成率實驗：

單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆。克隆形成卒用來表示細胞的增殖能力?？寺⌒纬陕时龋娇寺⌒纬蓴?shù)／接種細胞數(shù)缺點：操作繁瑣優(yōu)點：精確、可靠第38頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.臺盼藍法