細胞分離技術(shù)

關(guān)于細胞分離技術(shù)2部分微生物胞內(nèi)酶第一節(jié)細胞分離第2頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3胞內(nèi)重組藥物

設(shè)計試驗，請用生物工程學(xué)的原理和方法生產(chǎn)治療糖尿病的胰島素？第3頁,共65頁，2024年2月25日，星期天4

分離胞內(nèi)產(chǎn)物與胞外產(chǎn)物的差別是什么？為回收和提純胞內(nèi)產(chǎn)品,必須先將它們從胞內(nèi)釋放到胞外,然后進行分離純化。可以采用分泌性宿主使胞內(nèi)產(chǎn)物直接分泌到胞外;也可用破碎細胞的方法使其釋放出來。第4頁,共65頁，2024年2月25日，星期天5細胞與液體物質(zhì)的分離又稱為固液分離，固液分離方法包括過濾與離心沉降。一、過濾指利用多孔性介質(zhì)截流固體懸浮液中的固體顆粒，進行固液分離的方法。過濾不但是傳統(tǒng)的化工單元，而且是目前工業(yè)生產(chǎn)中用于分離細胞和不溶性物質(zhì)的主要方法。第5頁,共65頁，2024年2月25日，星期天6過濾一般過濾：微生物、動植物細胞膜過濾：蛋白質(zhì)等物質(zhì)的選擇性分離一般過濾：以壓力差作為推動力。第6頁,共65頁，2024年2月25日，星期天7二、離心沉降沉降法：指固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)做相對運動最終實現(xiàn)固液分離的技術(shù)。沉降法根據(jù)作用外力的不同，可分為重力沉降和離心沉降。第7頁,共65頁，2024年2月25日，星期天8離心沉降是利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進行的一項分離、濃縮或提取條件。1）離心沉降的原理：固體和液體之間存在一定的密度差，且固體密度大于液體的密度。2）影響離心沉降速度的因素密度差、顆粒大小、液體粘度、離心力大小第8頁,共65頁，2024年2月25日，星期天9斯托克斯公式：u=d2(ρs－ρ)rω2/18μ1)密度差越大(ρs－ρ)，離心沉降速度越快；2)固體顆粒尺寸越大，越容易離心;3)液體粘度μ越大，越不容易離心；4)離心力rω2的大小對固液分離影響很大。第9頁,共65頁，2024年2月25日，星期天103）離心機的分類分離因數(shù)Fr＝rω2／g分離因數(shù)Fr的大小分為1)Fr＜3000常速離心機2)Fr＝3000～5000中速離心機3)Fr≥5000高速離心機4)Fr=2×104～106超速離心機第10頁,共65頁，2024年2月25日，星期天11離心分離法根據(jù)其操作方式的不同，又可分為差速離心和密度梯度離心。1)差速離心法如果所要的蛋白質(zhì)(或生物大分子)主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞質(zhì)等；則可利用差速離心（differentialcentrifugation）方法將它們分開收集，該細胞組分作為下步純化的材料。第11頁,共65頁，2024年2月25日，星期天12優(yōu)點：可以一下子除去很多雜蛋白質(zhì)，使純化工作容易得多。如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細胞膜或膜質(zhì)細胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當?shù)慕橘|(zhì)提取。第12頁,共65頁，2024年2月25日，星期天13差速離心法的原理差速離心是利用不同離心速度產(chǎn)生不同離心力，將各種亞細胞組分和各種顆粒分別分開。不同物質(zhì)有不同的形狀、大小、質(zhì)量和密度，當在介質(zhì)中離心時，它們的沉降速度各有差異。第13頁,共65頁，2024年2月25日，星期天14大的顆粒碎片在低速時很快沉降，被分離的物質(zhì)留在上清液中;逐步增加離心力，進一步離心上清液，使中等顆粒沉降，最后是大小和密度最小的顆粒沉降。注意：每次得到的沉淀，必須經(jīng)過幾次洗滌后，反復(fù)懸浮和離心，才能得到比較純的部分。第14頁,共65頁，2024年2月25日，星期天15差速離心圖示第15頁,共65頁，2024年2月25日，星期天16差速離心的方法為了將細胞中各種組分純化分離，首先要在等滲緩沖液中把細胞破碎勻漿;然后用差速離心的方法，把勻漿液中的各種組分分離;在離心場中，不同大小的顆粒沉向離心管底部的速率不同。第16頁,共65頁，2024年2月25日，星期天17差速離心的方法當離心力低，離心時間短時，細胞核即可沉到管底；加大離心力后，又可分離出線粒體；離心力再加大，才能分離出微粒體和核糖體。最后幾步的超離心力，可超過地心引力的10萬倍以上，懸液經(jīng)離心分離出核糖體以后所剩的上清液，則是由細胞原生質(zhì)的可溶性部分和極微小的顆粒所組成，這些組分則需要更嚴格的離心方法才能分離出來第17頁,共65頁，2024年2月25日，星期天182)一般密度梯度離心法也稱分級區(qū)帶離心，有：1）蔗糖密度梯度離心2）氯化銫密度梯度離心用于RNA-DNA混合物、核蛋白體亞單位和其他細胞成分的分離第18頁,共65頁，2024年2月25日，星期天19一般密度梯度離心法：把樣品鋪放在一個連續(xù)的液體密度梯度上，然后進行離心，并控制離心分離的時間，使得粒子完全沉降之前，在液體梯度中移動而形成不連續(xù)的分離區(qū)帶。第19頁,共65頁，2024年2月25日，星期天20一般密度梯度離心圖示第20頁,共65頁，2024年2月25日，星期天213)等密度梯度離心法等密度梯度離心法：不同粒子存在密度差時，在離心力場作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）并形成區(qū)帶，此即等密度梯度離心法。第21頁,共65頁，2024年2月25日，星期天22等密度梯度離心法第22頁,共65頁，2024年2月25日，星期天23三、離心過濾 1）離心過濾的原理以離心力作為推動力完成過濾操作,具有離心和過濾的雙重作用。2）影響離心過濾速度的因素過濾面積和離心力第23頁,共65頁，2024年2月25日，星期天24離心過濾機可分離固體密度大于或小于液體密度的懸浮液。可分為:連續(xù)式離心機和間歇式離心機。第24頁,共65頁，2024年2月25日，星期天25第二節(jié)細胞破碎細胞破碎：指選用物理，化學(xué)，酶或機械的方法來破壞細胞壁或細胞膜。第25頁,共65頁，2024年2月25日，星期天26一、細胞壁結(jié)構(gòu)細胞壁化學(xué)組成非常復(fù)雜,取決于微生物類型細胞的年齡細胞的生長生理學(xué)多糖，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上的排列方式第26頁,共65頁，2024年2月25日，星期天27細胞壁的結(jié)構(gòu)第27頁,共65頁，2024年2月25日，星期天28二、細胞破碎率破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分數(shù)。1）直接記數(shù)法2）間接記數(shù)法第28頁,共65頁，2024年2月25日，星期天291）直接記數(shù)法平板計數(shù)技術(shù)需時長；只有活細胞才能計數(shù)；會產(chǎn)生誤差血球細胞器上用顯微鏡計數(shù)快速而簡單，但細胞小計數(shù)困難第29頁,共65頁，2024年2月25日，星期天302）間接記數(shù)法在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。將破碎后的細胞懸液離心去掉固體（完整細胞和碎片），然后對上清液進行含量或活性分析。酶活性是破碎程度的很好指示參數(shù)。第30頁,共65頁，2024年2月25日，星期天31三、細胞破碎的方法破碎方法機械法非機械法固體剪切作用液體剪切作用珠磨法壓榨法高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法第31頁,共65頁，2024年2月25日，星期天321）珠磨法（圖3-6）作用機理：微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑在攪拌漿作用下充分混勻，珠子之間及珠子與細胞之間相互剪切、碰撞，促使細胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。第32頁,共65頁，2024年2月25日，星期天33影響因素：①轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速：破碎比速度與轉(zhuǎn)盤速度成正比。②細胞濃度：最佳濃度應(yīng)由實驗確定。濃度大，產(chǎn)生的熱量大，但單位細胞重量所消耗的功率小。③珠粒大?。涸谝欢ǚ秶鷥?nèi)，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能過小。第33頁,共65頁，2024年2月25日，星期天34④溫度：將溫度控制在5～40℃對破碎物影響較小。⑤流量：流量大，加工單位質(zhì)量細胞消耗的能量減小，但細胞的破碎程度和蛋白質(zhì)的釋放量會降低。第34頁,共65頁，2024年2月25日，星期天35

溫控與能耗珠磨機是采用夾套冷卻的方式實現(xiàn)溫度控制的，一般情況下能將溫度控制在要求的范圍內(nèi)；珠磨機的能耗與細胞破碎率成正比；高的破碎率會提高分離的成本。第35頁,共65頁，2024年2月25日，星期天362)高壓勻漿法（圖3-8）作用機理從高壓室壓出的細胞懸浮液，經(jīng)過閥座的中心孔道從閥座和閥桿之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達幾百米每秒。這種高速噴出的懸液又射擊到靜止的碰撞環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。第36頁,共65頁，2024年2月25日，星期天37

溫控與能耗活性物質(zhì)在破碎過程中的失活問題。蛋白質(zhì)和酶的失活主要由勻漿過程中產(chǎn)生的熱引起。如果能將溫度控制在35oC以下，酶失活的損失可以忽略。提高壓力有利于細胞破碎，但需增加能耗。機械破碎的能耗主要包括提供動力消耗的能量及低溫操作消耗的能量。第37頁,共65頁，2024年2月25日，星期天383)超聲波法作用機理聲頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入可以引起空化現(xiàn)象，使氣泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象。第38頁,共65頁，2024年2月25日，星期天39此法多適用于微生物材料、細胞培養(yǎng)材料的破碎；因超聲波處理時產(chǎn)熱較多，故應(yīng)用此法時，需要采取降溫措施；另外，某些核酸及酶對超聲波敏感，慎用此法。第39頁,共65頁，2024年2月25日，星期天40超聲波破碎過程效率的影響因素：①聲頻②聲能③處理時間④細胞濃度⑤菌種類型第40頁,共65頁，2024年2月25日，星期天41四)化學(xué)滲透法

用化學(xué)藥品改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來，這種處理方式稱為化學(xué)滲透法。作用機理化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型及細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。不同試劑對各種微生物細胞作用的部位和方式有所差異。第41頁,共65頁，2024年2月25日，星期天42有機溶劑（苯、甲苯）表面活性劑有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）表面活性劑處理法使細胞膜破壞。金屬螯合劑（EDTA）變性劑（鹽酸胍、脲）第42頁,共65頁，2024年2月25日，星期天43五)酶溶法

用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法。溶菌酶、?-1，3-葡聚糖酶、?-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鏈內(nèi)切酶等。第43頁,共65頁，2024年2月25日，星期天44作用機理溶酶具有高度專一性，蛋白酶只能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系統(tǒng)處理細胞必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的使用次序。第44頁,共65頁，2024年2月25日，星期天45酶溶法的優(yōu)點：①產(chǎn)品釋放的選擇性高②抽提的速率和收率高③產(chǎn)品的破壞最少④對pH和溫度等外界條件要求低⑤不殘留細胞碎片第45頁,共65頁，2024年2月25日，星期天46六)物理法①滲透壓沖擊法②反復(fù)凍融法多用于動物細胞。將細胞在-20℃以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。③低溫玻璃化法指從超微結(jié)構(gòu)上損傷細胞，使細胞壁、細胞膜等成分遭受破壞。第46頁,共65頁，2024年2月25日，星期天47各種破碎方法的比較及選擇分類具體方法優(yōu)缺點及適用范圍機械破碎法珠磨法破碎率高，適用范圍廣，但后處理復(fù)雜高壓均漿法破碎率高，可大規(guī)模操作，適用范圍小超聲波破碎適用于實驗室小規(guī)模操作物理破碎法凍融法操作簡便，但不適用于對冷凍敏感的細胞低溫玻璃化成本高，適用于實驗室小規(guī)模生產(chǎn)化學(xué)滲透法加入特定化學(xué)試劑選擇性高，細胞碎片大，后處理容易；但作用時間長，適用范圍小酶溶法加入酶選擇性高，細胞碎片大，后處理容易；但成本高，適用范圍小第47頁,共65頁，2024年2月25日，星期天48細胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向①多種破碎方法相結(jié)合②與下游過程相結(jié)合破碎過程要易于細胞碎片的除凈。③與上游過程相結(jié)合培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)等。第48頁,共65頁，2024年2月25日，星期天49第三節(jié)胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性一、包含體及其形成二、包含體的分離和溶解三、蛋白質(zhì)復(fù)性第49頁,共65頁，2024年2月25日，星期天50（一）包含體及其形成

1)包含體的概念在基因工程菌細胞內(nèi)表達的重組蛋白，常?；ハ嘟宦?lián)在一起，形成不溶性的聚積物，通常稱為包含體。第50頁,共65頁，2024年2月25日，星期天51包含體在相差顯微鏡下呈現(xiàn)為許多個高度折光的顆粒，含有這些包含體的大腸桿菌的菌體變大，并出現(xiàn)突起部分。在電鏡下，包含體是無明顯的膜存在，大致為圓形，直徑可達1微米。包含體第51頁,共65頁，2024年2月25日，星期天52包涵體存在于包含體內(nèi)的重組蛋白通常無生物活性，其形成與否取決于蛋白質(zhì)的類型。含有二硫鍵的真核生物蛋白質(zhì)，在原核生物中進行表達，常常因重組蛋白內(nèi)及分子間二硫鍵的錯配，而產(chǎn)生無活性的蛋白質(zhì)，成為不溶性的物質(zhì)。第52頁,共65頁，2024年2月25日，星期天53包含體形成的原因①產(chǎn)生少量蛋白時，可溶，量過多時，在細胞內(nèi)超過其溶解度而沉淀；②蛋白質(zhì)合成速度太快，肽鏈來不及形成正常的折疊構(gòu)象，導(dǎo)致分子間因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影響；第53頁,共65頁，2024年2月25日，星期天54③高表達的蛋白沒有形成正常的二硫鍵，或宿主細胞內(nèi)氧化還原等條件不同而生成不同的-S-S-；④蛋白的溶解需要與其他成分結(jié)合或經(jīng)其他成分誘導(dǎo)形成適當?shù)目扇苄詷?gòu)象，當產(chǎn)生的蛋白量過多，所需其他成分相對不足，如折疊酶，分子伴侶等。第54頁,共65頁，2024年2月25日，星期天55⑤包含體的形成亦與蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定性有關(guān)。第55頁,共65頁，2024年2月25日，星期天56二、包含體的分離和溶解包含體存在于細胞質(zhì)中，其分離：①破碎細胞（如高壓勻漿，或超聲波處理，或溶菌酶等）②離心（5000-20000r/min，15min）③得到包含體沉淀第56頁,共65頁，2024年2月25日，星期天57包含體的溶解1)溶解常用試劑:尿素鹽酸胍去污劑SDS2)二硫鍵的還原劑:二硫基蘇糖醇(DTT)2-巰基已醇破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)破壞肽鏈之間的疏水作用使二硫鍵處于可逆斷裂狀態(tài)第57頁,共65頁，2024年2月25日，星期天58三、蛋白質(zhì)復(fù)性正確構(gòu)象的形成需要進行變性和復(fù)性在結(jié)構(gòu)上：使伸展的肽鏈成為特定的三維結(jié)構(gòu)；在功能上：使無活性的分子成為具有特定功能的分