碳青霉烯類耐藥性在人源和動(dòng)物源產(chǎn)NDM酶大腸埃希菌間的傳播

一、引言抗生素耐藥性是21世紀(jì)全球最大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一，碳青霉烯類藥物是我們治療危及生命的多重耐藥菌感染的最有效抗生素之一。不幸的是，碳青霉烯耐藥腸桿菌（CRE）的快速傳播是目前困擾住院患者和醫(yī)生的主要問題，因?yàn)镃RE對(duì)碳青霉烯類藥物、頭孢菌素類藥物和青霉素類藥物均表現(xiàn)出高水平耐藥性，嚴(yán)重限制了治療方案。因此，CRE被稱為“夢(mèng)魘細(xì)菌”，同時(shí)伴隨著大量的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并被列為首要的公共健康威脅之一以及迫切需要優(yōu)先研發(fā)新抗生素的病原體。

目前，世界范圍內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)的CRE菌株主要產(chǎn)三種碳青霉烯酶：新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶（NDM）、肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）和可水解碳青霉烯的氧青霉烯酶-48型β-內(nèi)酰胺酶（OXA-48）。產(chǎn)NDM菌株在50多個(gè)國(guó)家廣泛流行，特別是在南亞（印度、巴基斯坦和孟加拉國(guó)）和中國(guó)，而產(chǎn)KPC菌株更普遍在北美洲和南美洲（美國(guó)、阿根廷和巴西）以及在中國(guó)和歐洲（希臘、意大利和以色列）流行。一項(xiàng)涉及36個(gè)歐洲國(guó)家的跨國(guó)研究顯示，醫(yī)院獲得性碳青霉烯耐藥大腸桿菌（CREC）中NDM和KPC陽(yáng)性率分別為10.3%和7.2%。在中國(guó)，2014—2015年在25個(gè)省份收集的產(chǎn)NDM和KPC臨床分離株分別占所有CREC的49.4%和39.6%。相反，在另一項(xiàng)中國(guó)19個(gè)省份健康人群的研究中，46.7%的CREC中blaNDM是唯一檢測(cè)到的碳青霉烯酶基因。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，NDM是中國(guó)大多數(shù)人源CREC菌株的碳青霉烯酶。

在世界范圍內(nèi)來自食品、野生和伴侶動(dòng)物的CREC菌株中，NDM仍然是流行最廣的碳青霉烯酶。在中國(guó)，產(chǎn)NDM菌株正成為食品動(dòng)物中最主要的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，并污染下游的肉制品，其中，blaOXA-48和blaKPC極少出現(xiàn)。然而，盡管有一些證據(jù)表明CREC可在人與動(dòng)物之間直接傳播，但迄今為止，動(dòng)物來源的CREC還沒有被普遍認(rèn)為是影響人類健康的問題之一。二、材料和方法（一）研究設(shè)計(jì)

圖1展示了本項(xiàng)研究的框架。文章由回顧性橫斷面研究開始。首先，從中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CHINET）中，獲得在2016年1月1日至12月31日期間，中國(guó)30家醫(yī)院的門診患者和住院患者中收集的共計(jì)29799株大腸桿菌分離株。這些醫(yī)院多數(shù)為大型診療機(jī)構(gòu)，共覆蓋22個(gè)?。ㄖ陛犑校谑。ㄖ陛犑校┛?cè)丝诩s9億。為了避免重復(fù)，根據(jù)患者識(shí)別代碼，臨床標(biāo)本中每個(gè)患者僅包含一個(gè)分離株。物種鑒定采用自動(dòng)化系統(tǒng)，如Vitek2Compact（bioMérieux，法國(guó)）和Phoenix-100（Becton,DickinsonandCompany，美國(guó)）系統(tǒng)或基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS;BrukerDaltonics，德國(guó)）。使用Vitek2Compact自動(dòng)系統(tǒng)（bioMérieux）測(cè)定分離株對(duì)19種臨床抗菌藥物（頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、甲氧芐啶/磺胺甲??唑、磷霉素、黏菌素、呋喃妥因和替加環(huán)素）的敏感性。藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，至少對(duì)一種碳青霉烯類藥物具有抗性的菌株被定義為CREC（圖1）。

圖1.

數(shù)據(jù)來源及研究流程圖。MIC：最小抑菌濃度；CSEC：碳青霉烯敏感大腸桿菌；pos：陽(yáng)性；neg：陰性。

其次，于2017年4月1日至5月31日間在遼寧、湖南和陜西三個(gè)省各收集22個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)和16個(gè)雞養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便樣本，以評(píng)估blaNDM和blaKPC的總體豐度；關(guān)于樣本采集和處理過程的細(xì)節(jié)已在之前的研究中描述，如果提取的DNA質(zhì)量不足以進(jìn)行下一步分析，則排除該養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)據(jù)（圖1）。如前所述，使用qPCR方法以16SrRNA基因?yàn)閷?duì)照，評(píng)估blaNDM和blaKPC的相對(duì)豐度。

再次，對(duì)全球的動(dòng)物源和人源CREC菌株進(jìn)行了全面的基因組研究，以確定它們?cè)诨?、質(zhì)粒和菌株水平上的基因組特征和關(guān)聯(lián)（圖1）。詳細(xì)的過程將在下文中描述。本研究于2015年11月24日獲得復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)的道德許可（項(xiàng)目號(hào)：KY2015-285）。個(gè)人同意書采用普通話版本，并從所有住院患者那里通過面對(duì)面或電話交流獲得同意。研究排除了不愿意參與本研究的個(gè)體，并且所有參與者都被告知他們有權(quán)在任何階段退出本研究。

（二）數(shù)據(jù)來源

中國(guó)22個(gè)省（直轄市）的人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來自中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局和《中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒》。人為因素共分為6類，包括：國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值（GDP）、人口（數(shù)量和密度）、抗菌藥物使用、動(dòng)物生產(chǎn)（食品動(dòng)物和淡水養(yǎng)殖，主要是魚和蝦）、動(dòng)物源性食品消費(fèi)和每日動(dòng)物源性食品攝入量。大部分?jǐn)?shù)據(jù)收集于2015年，抗菌藥物使用數(shù)據(jù)來自2013年。

在基因組分析中，我們從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了所有可用的中國(guó)NDM陽(yáng)性大腸桿菌全基因組序列（n

=463）用于綜合分析。我們還從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了來自4個(gè)宿主（人、豬、雞、蠅）的1852株NDM陰性大腸桿菌的基因組序列，相當(dāng)于NDM陽(yáng)性序列總數(shù)的4倍（圖1）。所有菌株均給予有序自然數(shù)，并使用Excel中的RAND函數(shù)隨機(jī)選擇進(jìn)行相應(yīng)分析。

（三）基因組分析

基因組序列分析包括基因組組裝、多位點(diǎn)序列分型、質(zhì)粒檢測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育種群預(yù)測(cè)，具體描述見已發(fā)表的文章。使用Bandage（0.8.1版）對(duì)不含質(zhì)粒復(fù)制子基因的序列片段進(jìn)行分析，以確定可能的質(zhì)粒類型。桑基圖由R3.6.1中的networkD3軟件包（0.4版本）生成。所有組裝后的NDM陽(yáng)性基因組序列用于核心基因組比對(duì)，通過RedDogpipeline生成系統(tǒng)發(fā)育樹。該樹使用TreeofLifev5進(jìn)行可視化處理。

（四）溯源分析

我們使用DAPC（discriminantanalysisofprincipalcomponents）模型來預(yù)測(cè)所有NDM陽(yáng)性大腸桿菌的潛在來源。所有菌株（n

=2315）的核心基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP）圖譜，包括NDM陰性的大腸桿菌，均使用snippypipeline生成。用于DAPC模型的1389株NDM陰性大腸桿菌的SNP矩陣通過R3.6.1中的Adegenet軟件包實(shí)現(xiàn)。其余463株陰性菌株用于評(píng)估上述模型的擬合度。最后，利用構(gòu)建的DAPC模型預(yù)測(cè)了所有中國(guó)NDM陽(yáng)性菌株（n

=463）的遺傳來源。預(yù)測(cè)組∶訓(xùn)練組∶測(cè)試組=1∶3∶1。

（五）統(tǒng)計(jì)分析

將人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和非臨床數(shù)據(jù)輸入Excel2016，將變量“年齡”分為7個(gè)亞組（嬰兒、學(xué)齡前兒童、學(xué)齡兒童、青少年、青年、成人和老年人），同時(shí)將變量“感染部位”分為5個(gè)亞組（血液、尿液、痰液、腦脊液和其他）。此外，基于之前對(duì)雞生產(chǎn)和國(guó)家豬生產(chǎn)計(jì)劃的研究，我們根據(jù)年出欄量將中國(guó)大陸分別劃分為2個(gè)雞生產(chǎn)區(qū)和4個(gè)豬生產(chǎn)區(qū)。分類數(shù)據(jù)采用χ2分析檢驗(yàn)，連續(xù)數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney

U檢驗(yàn)。在SPSS23.0版本（IBM，美國(guó)）中進(jìn)行單變量分析，隨后使用Cramer系數(shù)（Φ）對(duì)P值≤0.05的變量進(jìn)行共線性評(píng)估。如果一對(duì)變量高度相關(guān)（Φ

>4.0），我們選擇更具生物邏輯合理性的變量進(jìn)行多變量邏輯回歸分析。單變量分析中具有顯著性意義的變量將被用于多變量分析。采用向前逐步（似然比）方法對(duì)多變量邏輯回歸分析中的混雜因素進(jìn)行控制。最終模型中保留P值小于0.05的變量。邏輯回歸模型的擬合優(yōu)度采用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)。森林圖使用R語(yǔ)言中的forestplot包生成。

使用R3.6.1對(duì)

blaNDM的豐度進(jìn)行分析和可視化。當(dāng)豐度值低于檢測(cè)限時(shí)，添加一個(gè)偽數(shù)值1×10-7（低于最低豐度一個(gè)數(shù)量級(jí)）后再進(jìn)行l(wèi)og10變換。不同組間的比較采用Mann-Whitney

U檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis

H檢驗(yàn)，取0.05為顯著性水平。

三、結(jié)果

（一）CREC與臨床和非臨床因素的相關(guān)性

本研究設(shè)計(jì)示意圖如圖1所示。在來自中國(guó)22個(gè)?。ㄖ陛犑校┑牟煌腥緲颖局泄卜蛛x到29799株大腸桿菌，其中，631株（2.1%）被鑒定為CREC。四川省的CREC流行率最高（4.7%），福建省無(wú)CREC分離株。對(duì)CREC感染患者的分析顯示，男女比例為1.4∶1，但根據(jù)單變量分析，男性CREC的感染率明顯高于女性（P

<0.0001）（圖2）。嬰兒（小于1歲）和青少年（13~18歲）的CREC感染率最高分別為3.5%和3.2%。尿液在陽(yáng)性樣本中所占比例最大（42.1%），但比值比最低（OR=0.7），95%的可信區(qū)間（CI）在0.6~0.9之間（表S2）。相比之下，腦脊液占陽(yáng)性樣本的比例最低（0.3%），但流行率最高（5.2%）?？偟膩碚f，26/29個(gè)變量與CREC感染（P≤0.05）顯著相關(guān)（表S2）。排除高度共線性變量后，6個(gè)非臨床變量和3個(gè)人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量被納入多變量邏輯回歸分析[圖2（b）]。在三個(gè)臨床分類變量中，男性感染CREC的ORs（OR=1.6,95%CI:1.3~1.8）高于女性，嬰兒和青少年也表現(xiàn)出更高的ORs（OR=3.4,95%CI:1.8~6.5和OR=3.1,95%CI:1.3~7.5）。尿路感染的ORs最低（OR=0.8,95%CI:0.6~0.9）。對(duì)三種非臨床分類變量而言，在GDP較高地區(qū)或更高的雞出欄量（OR=1.4,95%CI:1.1~1.8；表S2）和豬出欄量地區(qū)（OR=5.5,95%CI:3.5~8.7；表S2）的人群有更高的CREC感染率。Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)[χ2

=11.35，自由度（d.f.）=8，P

=0.182>0.05]表明所選的模型適合當(dāng)前的數(shù)據(jù)。

圖2.

單變量（a）和多變量（b）分析的森林圖。

（二）敏感性試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)表明，CREC（n

=631）對(duì)頭孢菌素、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和氟喹諾酮類（58.8%~95.7%）的耐藥性明顯高于碳青霉烯敏感大腸桿菌（carbapenem-susceptible

E.coli,CSEC;

n

=29168,2.9%~59%）（P

<0.0001）（表1）。CREC對(duì)阿米卡星和磷霉素的耐藥率分別為16.8%和28.5%，而CSEC對(duì)阿米卡星和磷霉素的耐藥率分別為2.7%和5.6%。CREC和CSEC對(duì)黏菌素和替加環(huán)素的敏感性均較高（大于96.7%）。值得注意的是，59%的CSEC對(duì)頭孢噻肟表現(xiàn)出耐藥性（表1）。雖然無(wú)法獲得CHINET分離株的耐藥基因型，但可利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)臨床大腸桿菌分離株（NDM陽(yáng)性菌株和陰性菌株分別為195株和494株）的序列檢測(cè)兩組間的耐藥基因陽(yáng)性率?？偟膩碚f，除mcr和oqxAB基因外，NDM陽(yáng)性菌中大多數(shù)抗菌藥物的耐藥基因，特別是β-內(nèi)酰胺耐藥基因（blaCTX-M、blaOXA和blaCMY）的陽(yáng)性率顯著高于陰性菌株。最近上傳至NCBI的不攜帶NDM的mcr陽(yáng)性菌株數(shù)量的增加可能是導(dǎo)致NDM陰性菌株中mcr基因陽(yáng)性率更高的原因；該結(jié)果與我們的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相一致——NDM陰性菌株對(duì)黏菌素的耐藥性高于陽(yáng)性菌株。表1

臨床CREC和CSEC分離株的藥敏數(shù)據(jù)

（三）畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)樣本中的豐度

由于臨床CREC感染與省份間畜禽生產(chǎn)規(guī)模有很強(qiáng)的相關(guān)性，通過收集湖南、遼寧、陜西的豬、雞養(yǎng)殖場(chǎng)糞便樣本（每省份各22家豬養(yǎng)殖場(chǎng)和16家雞養(yǎng)殖場(chǎng)），以確定blaNDM和blaKPC的豐度。剔除無(wú)效DNA提取物后，對(duì)61個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)和45個(gè)雞養(yǎng)殖場(chǎng)的樣本進(jìn)行分析。所有養(yǎng)殖場(chǎng)均為blaKPC陰性；然而，分別有73.8%（n

=45）和62.2%（n

=28）的豬養(yǎng)殖場(chǎng)和雞養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)到blaNDM，基因相對(duì)豐度范圍分別為1×10-5~1×10-3和1×10-3~1×10-2（blaDNM/16SrRNA）?？傮w而言，雞養(yǎng)殖場(chǎng)和豬養(yǎng)殖場(chǎng)中blaNDM豐度的中位數(shù)相似（P=0.0758）；然而，湖南省一個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)和遼寧省一個(gè)雞養(yǎng)殖場(chǎng)的blaNDM豐度值異常高，分別為0.2467和0.2465。

（四）動(dòng)物源和人源NDM陽(yáng)性大腸桿菌間的保守序列分型

由于NDM是CREC菌株中主要的碳青霉烯酶，因此利用生物信息學(xué)手段進(jìn)一步研究了動(dòng)物源和人源NDM陽(yáng)性大腸桿菌間的關(guān)系。用463株NDM陽(yáng)性大腸桿菌和463株隨機(jī)選擇匹配的NDM陰性大腸桿菌（1∶1）構(gòu)建了基于序列分型（sequencingtypes,STs）的最小生成樹，其菌株來源組成為人（195vs217）、豬（99vs110）、雞（123vs136）和蒼蠅（46vs0）。由于數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有蒼蠅來源的陰性菌株，因此該部分菌株按其他來源比例分配。總體而言，NDM陽(yáng)性大腸桿菌共有96種ST類型，其中，ST167（n

=62,13.4%）、ST156（n

=34,7.3%）和ST48（n

=31,6.7%）最多。相比之下，NDM陰性的大腸桿菌屬于158種ST類型，包括ST10（n

=47,10.2%）、ST101（n

=16,3.5%）和ST48（n

=15,3.2%）。分別有16（n

=111）、11（n

=90）和10（n

=96）種STs在人源NDM陽(yáng)性大腸桿菌與雞、豬和蒼蠅源NDM陽(yáng)性大腸桿菌中同時(shí)存在，而在人源NDM陰性菌中，分別有25（n

=93）和19（n

=77）種STs與雞和豬的相關(guān)STs重疊。在所有4個(gè)來源中均檢出了屬于ST167、ST206、ST10和ST48的NDM陽(yáng)性菌株。其中，85.9%的（55/64）ST167和62.1%（18/29）的ST10分別來自人和豬。

（五）動(dòng)物源和人源NDM陽(yáng)性菌株/質(zhì)粒之間的基因組關(guān)聯(lián)研究利用463株NDM陽(yáng)性大腸桿菌間的362650個(gè)SNPs構(gòu)建了核心基因組系統(tǒng)發(fā)育樹，研究了菌株與質(zhì)粒水平上的關(guān)聯(lián)性（圖3和圖4）。通過種群結(jié)構(gòu)貝葉斯分析（BAPS），將4個(gè)來源的菌株劃分為11個(gè)譜系。人源菌株分布在所有譜系中，其中，L4譜系（n

=19）只有人源菌株（圖3）。L8譜系中含有的NDM陽(yáng)性大腸桿菌數(shù)量最多，共111株（24.0%），其中33（29.7%）、35（31.5%）、23（20.7%）和20株（18.0%）分別來自人、豬、雞和蒼蠅（圖3）。L11譜系中的87株菌來自上述4個(gè)來源，其中，63株（72.4%）來自人（圖3）。同一來源的菌株通常形成相似性極高的分支（大于99.95%，圖4中以粉紅色三角形表示），而在C1~C5分支中存在來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同來源的親緣關(guān)系緊密的菌株（圖4）。

圖3.

463株NDM陽(yáng)性大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。譜系由不同顏色的樹枝和樹右邊的豎條表示。右側(cè)?；鶊D展示了各譜系、分離來源、攜帶blaNDM的質(zhì)粒類型和NDM蛋白亞型之間的分布和聯(lián)系。所有的豎條都標(biāo)記有相應(yīng)的標(biāo)簽。

圖4.

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了5個(gè)主要分支C1~C5中不同宿主間最接近的遺傳關(guān)系?；?63株NDM陽(yáng)性菌株的SNP差異利用最大似然法構(gòu)建了中值有根系統(tǒng)發(fā)育樹。平均分支長(zhǎng)度小于0.0005（99.95%）的簇被折疊并用粉色三角形表示。三角形的大小與演化支中菌株的數(shù)量成正比。不同宿主之間親緣關(guān)系近的菌株用紅色三角形表示，同時(shí)5個(gè)遺傳關(guān)系最近的分支標(biāo)記為C1~C5。屬于這5個(gè)分支的菌株以粉紅色圓圈背景顯示，并標(biāo)記了確切的分支長(zhǎng)度。這些菌株的名稱和宿主分別用字符和不同顏色的圓點(diǎn)表示。

除105個(gè)不確定質(zhì)粒類型的blaNDM短序列和一個(gè)位于染色體上的blaNDM-5序列外，其余357個(gè)菌株中blaNDM的質(zhì)粒屬于19種不同的Inc類型（圖3）；其中，blaNDM-5（332,71.7%）為最常見NDM亞型，主要位于IncX3型質(zhì)粒上（255,76.8%）。值得注意的是，IncB/O/K/Z型質(zhì)粒（n

=40,8.6%）只攜帶blaNDM-9。總體而言，IncX3（275,59.4%）是所有來源和譜系的主要質(zhì)粒類型，在117（42.5%）、74（26.9%）、50（18.2%）和34株（12.4%）分別來自人、豬、雞和蒼蠅的菌株中發(fā)現(xiàn)。NDM陽(yáng)性的IncB/O/K/Z質(zhì)粒主要在雞源菌株中發(fā)現(xiàn)（35,87.5%），而人源菌株中不存在該類型質(zhì)粒（圖3）。

（六）NDM陽(yáng)性大腸桿菌的來源預(yù)測(cè)

采用DAPC方法預(yù)測(cè)463株NDM陽(yáng)性分離株的來源，其中，測(cè)試組共463株NDM陰性株，訓(xùn)練組共1389株NDM陰性株（比例為1∶1∶3）。雖然DAPC模型預(yù)測(cè)了來自人、雞和豬的菌株之間存在密切的遺傳關(guān)系，但仍可觀察到一個(gè)可區(qū)分的邊界[圖5（a）]，隨后選擇了代表結(jié)果預(yù)測(cè)效果最好的前600個(gè)主成分（共1200個(gè)）進(jìn)行分析[圖5（b）]。在測(cè)試組中該模型預(yù)測(cè)的菌株來自雞、蒼蠅、人和豬的準(zhǔn)確率分別為87.4%、83.9%、88.3%和83.5%[圖5（c）]。通過該模型，19.5%(n

=24)、8.1%(n

=10)和1.6%(n

=2)的雞源NDM陽(yáng)性大腸桿菌（n

=123）可能來自人、豬和蒼蠅，而27.3%（27/99）的豬源NDM陽(yáng)性大腸桿菌可能來自人[圖5（d]。雖然30.8%（60/195）的人源分離株似乎沒有改變宿主，但預(yù)計(jì)分別有53.8%（n

=105）和14.9%（n

=29）的菌株分別來自雞和豬[圖5（d）。所有蒼蠅源菌株（n

=46）分別來自人（n

=5,10.9%）、雞（n

=22,47.8%）和豬（n

=19,41.3%）[圖5（d）]。圖5.

使用DAPC模型對(duì)NDM陽(yáng)性大腸桿菌溯源。（a）訓(xùn)練集的散點(diǎn)圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)菌株，不同的顏色表示不同的來源。橢圓表示每個(gè)原點(diǎn)的95%CI。（b）DAPC模型的交叉驗(yàn)證。（c）測(cè)試集的表格圖。（d）預(yù)測(cè)集的表格圖。行和列分別表示報(bào)告的來源和預(yù)測(cè)的來源，每個(gè)正方形的大小表示相應(yīng)的菌株數(shù)量。PCA：主成分分析。四、討論研究數(shù)據(jù)涵蓋來自22個(gè)?。ㄖ陛犑校┑臉颖?，代表了中國(guó)最大的臨床CREC監(jiān)測(cè)研究。來自中國(guó)30家醫(yī)院的感染相關(guān)大腸桿菌分離株中CREC的總流行率（2.1%,631/29799,CHINET,2016）高于歐洲（0.1%，未提供/121582，EARS-Net，2016）和美國(guó)（0.3%，5/1916，30家醫(yī)院，2015—2017年）。本研究中CREC感染與男性存在正相關(guān)，這與之前的報(bào)道一致。在我們目前的研究中發(fā)現(xiàn)，嬰兒（<1歲）被CREC感染的概率最高，近期一篇關(guān)于美國(guó)兒童中有較高CRE感染率的報(bào)道也印證了這一點(diǎn)。嬰兒的微生物群落變化較大，容易受到抗生素的干擾，這可能為CRE定植提供了機(jī)會(huì)，這已被證明是老年重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）患者內(nèi)源性感染的風(fēng)險(xiǎn)因素。有趣的是，人類和動(dòng)物中使用的β-內(nèi)酰胺類藥物的排放與CREC感染沒有顯著相關(guān)性，這意味著β-內(nèi)酰胺類藥物向環(huán)境中的排放可能不是CREC傳播的主要驅(qū)動(dòng)因素。研究表明，β-內(nèi)酰胺類藥物在室溫會(huì)迅速降解，這可能導(dǎo)致它們?cè)诃h(huán)境中幾乎不產(chǎn)生選擇壓力。

研究首次確定了畜禽養(yǎng)殖量與人類CREC感染之間的正相關(guān)關(guān)系。微觀基因組分析提供了幾個(gè)支持這種聯(lián)系的證據(jù)。首先，我們觀察到在中國(guó)三個(gè)省的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便樣本中，blaNDM的豐度很高，而不含有blaKPC。其次，從人、雞、豬和蒼蠅分離株中鑒定出具有相似的攜帶blaNDM的IncX3質(zhì)粒，然而在目前和以前的研究中blaKPC很少在動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。第三，鑒定了來自人和動(dòng)物源NDM陽(yáng)性大腸桿菌核心基因組序列之間的密切關(guān)系。第四，溯源分析顯示，人和動(dòng)物源的NDM陽(yáng)性大腸桿菌之間的分界模糊。綜上所述，這些觀察表明NDM陽(yáng)性CREC菌株在動(dòng)物和人類之間存在顯著的傳播風(fēng)險(xiǎn)。值得注意的是，動(dòng)物源性食品的消費(fèi)與CREC感染間的關(guān)系僅在單變量分析時(shí)呈現(xiàn)顯著相關(guān)，在多變量邏輯回歸分析中則無(wú)顯著相關(guān)，表明其他可能的傳播途徑（如污染物傳播）也是blaNDM質(zhì)?；駽REC擴(kuò)散的一個(gè)因素。例如，在包括醫(yī)院污水、廢水、飲用水、自然水道和其他來源的多個(gè)環(huán)境樣本中均檢測(cè)到blaNDM以及伴侶動(dòng)物、蒼蠅和野生動(dòng)物中也分離到攜帶NDM的菌株。此外，先前研究報(bào)道了CREC通過環(huán)境在動(dòng)物和人類之間傳播。以上證據(jù)均表明環(huán)境污染物是潛在的傳播驅(qū)動(dòng)因素。

blaNDM在動(dòng)物和人類之間的成功傳遞可能包括以下證據(jù)。首先，blaNDM-IncX3質(zhì)粒的流行率為76.8%，出現(xiàn)在各主要譜系的CREC內(nèi)（圖3），提示該質(zhì)粒可能是非宿主特異性質(zhì)粒；此外，本研究中可能低估了blaNDM-IncX3質(zhì)粒的流行率，因?yàn)榇罅繑y帶NDM（n

=105）的序列太短，無(wú)法確認(rèn)其質(zhì)粒類型，許多可能是IncX3型質(zhì)粒。其次，攜帶blaNDM的質(zhì)粒——特別是blaNDM-IncX3——對(duì)宿主細(xì)菌幾乎沒有適應(yīng)性代價(jià)，增加了其在不同生態(tài)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性和持續(xù)性。第三，除了獸醫(yī)禁用的碳青霉烯類藥物外，包括青霉素和頭孢菌素在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類藥物，是中國(guó)（2018年3192t）和其他116個(gè)世界動(dòng)物健康組織成員國(guó)（2015—2017年間占總抗菌使用量的16.1%）用于食品動(dòng)物養(yǎng)殖的第二大類抗菌藥物。這些常用的β-內(nèi)酰胺藥物主要被用于飲用水中，可能對(duì)畜禽中NDM陽(yáng)性細(xì)菌的選擇和持續(xù)存在發(fā)揮重要作用。第四，blaNDM和包括mcr-1

、floR和tet(A)等其他耐藥基因在可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上共存，可分別通過使用黏菌素、氟苯尼考和四環(huán)素將blaNDM共同篩選出來。

盡管我們的研究證據(jù)表明了CREC在動(dòng)物和人類之間的傳播，但仍存在一些局限性。第一，采樣方案可能在時(shí)間跨度方面不完全一致；然而，該研究的數(shù)據(jù)集足夠大，并通過流行病學(xué)和基因組學(xué)分析，提供了CREC在動(dòng)物和人類之間傳播的有力證據(jù)。第二，盡管以前的大規(guī)模監(jiān)測(cè)表明NDM可能是大腸桿菌中最普遍的碳青霉烯酶類型，但研究中仍缺少臨床CREC菌株中碳青霉烯酶類型的數(shù)據(jù)。第三，我們直接分析了動(dòng)物和人類感染之間的關(guān)聯(lián)，但沒有分析患者的腸道定植情況和相應(yīng)的動(dòng)物源性食品。然而，先前的研究表明，血液和尿路感染的病原體經(jīng)常來自腸道共生菌或食源性致病菌。第四，包括大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和梭狀芽孢桿菌在內(nèi)的腸桿菌類細(xì)菌是臨床感染菌中blaNDM的主要