用于精準(zhǔn)和響應(yīng)性治療胞質(zhì)耐藥菌的剛性藥物遞送系統(tǒng)

一、引言細(xì)菌耐藥性是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，例如，金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus），尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant

S.aureus，MRSA）會引起慢性和復(fù)發(fā)性感染，從而使人類和動物遭受嚴(yán)重疾病和死亡威脅。此外，細(xì)菌通過多種進(jìn)化策略來抵御抗菌藥物殺傷，如抗菌藥物耐受性的出現(xiàn)，抗菌藥物耐受性還可以促進(jìn)體內(nèi)細(xì)菌耐藥性的快速發(fā)展。令人擔(dān)憂的是，由宿主介導(dǎo)的抗菌藥物耐受性是普遍存在的，并且對于不同種類的胞外菌來說，這一現(xiàn)象在很大程度上被嚴(yán)重低估。例如，S.aureus可以在巨噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞中持續(xù)存在和復(fù)制，以耐受高水平的抗菌藥物。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)病原體作為“特洛伊木馬”加劇了細(xì)菌耐藥性危機(jī)。另外，自20世紀(jì)80年代后期以來，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）幾乎沒有批準(zhǔn)任何新類別的抗生素。因此迫切需要替代干預(yù)策略通過恢復(fù)現(xiàn)有抗菌藥物的療效來對抗胞質(zhì)病原菌感染。

納米顆粒是一種很有前景的遞送系統(tǒng)，可通過表面修飾或調(diào)整粒徑大小來增加細(xì)胞內(nèi)藥物累積。介孔二氧化硅納米顆粒（MSN）作為藥物遞送載體具有高比表面積、良好生物相容性和可生物降解性等優(yōu)勢，從而引起廣泛關(guān)注。然而，MSN的力學(xué)性能在很大程度上被忽略。同時，對于MSN等固有剛性納米顆粒如何調(diào)控細(xì)胞攝取尚不清楚。最近研究表明，納米顆粒的剛性在將藥物分選并集中到不同的亞細(xì)胞區(qū)室中起著至關(guān)重要的作用。因此，剛性調(diào)節(jié)遞送系統(tǒng)具有靶向宿主胞質(zhì)細(xì)菌的應(yīng)用潛力。此外，環(huán)境響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)通過減少抗菌藥物選擇性壓力和提高抗菌效率來改善治療效果，具有良好的發(fā)展前景。例如，納米凝膠、自組裝納米顆粒和仿生材料等通過識別內(nèi)源性刺激用于可控藥物釋放，已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。因此，精準(zhǔn)治療與剛性調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取的結(jié)合為未來設(shè)計智能抗菌藥物遞送系統(tǒng)以對抗MDR細(xì)菌病原體提供啟示。

本研究設(shè)計了易于合成且具有高生物相容性的磷脂涂覆二氧化硅納米顆粒，用于實(shí)現(xiàn)剛性增強(qiáng)細(xì)胞攝取和裝載抗菌藥物的胞內(nèi)重分布。MSN作為剛性功能化納米顆粒（RFN）遞送系統(tǒng)的核心骨架，在裝載抗菌藥物后，經(jīng)過磷脂涂覆后形成響應(yīng)性外膜，由此獲得RFN（圖1）。RFN通過剛性增強(qiáng)細(xì)胞攝取和抗菌藥物響應(yīng)性釋放的功能，達(dá)到精準(zhǔn)對抗細(xì)菌病原體目的。此外，通過調(diào)節(jié)RFN的磷脂成分來實(shí)現(xiàn)抗菌藥物的胞內(nèi)重分布，從而提高抗菌效率。RFN可以很容易地具備精準(zhǔn)識別、剛性增強(qiáng)內(nèi)吞作用和重新編程胞內(nèi)分布的能力。因此RFN為未來對抗胞質(zhì)細(xì)菌感染提供了有潛力的遞送系統(tǒng)。

圖1.

RFN通過內(nèi)吞作用靶向溶酶體中的細(xì)菌進(jìn)行精準(zhǔn)治療的示意圖。（a）通過增加納米顆粒的剛性增強(qiáng)其細(xì)胞攝取以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。將抗生素封裝在涂有磷脂的MSN中，用于增強(qiáng)胞質(zhì)遞送以提高對胞質(zhì)細(xì)菌的治療效率。（b）具有特異性識別功能的RFN磷脂酶響應(yīng)釋放和磷脂酶的作用位點(diǎn)示意圖。磷脂酶敏感的RFN可使抗生素在感染部位快速釋放，以響應(yīng)MDR細(xì)菌分泌的磷脂酶。（c）通過內(nèi)吞途徑內(nèi)化RFN后殺滅胞質(zhì)細(xì)菌。

二、材料與方法

（一）材料

硅酸四乙酯（TEOS）和三乙醇胺（TEA）購自阿拉丁公司（中國）。磷脂酶A2（PLA2,P9279）和磷脂酶C（PLC,P6621）購自Sigma-Aldrich公司（美國）。二硬脂酰磷脂酰甘油（PG）、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（PC）和膽固醇購自艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司（中國）。熒光親油染料3,3′-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate（Dio）和1,1′-dioctadecyl-3,3,3′?,3′-tetramethylindocarbocyanineperchlorate（Dil）購自碧云天生物技術(shù)公司（中國）。利福平（RIF）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。使用Milli-QPlus過濾系統(tǒng)（美國）生產(chǎn)去離子水。

（二）剛性功能化納米顆粒制備將PG、PC和膽固醇以8∶2∶1的質(zhì)量比混合溶解在氯仿中。將含有1mg磷脂的溶液在室溫下蒸發(fā)干燥過夜。然后將得到的薄膜與5mgMSN水合共擠出。使用兩個孔徑為200nm的聚碳酸酯膜（Whatman，美國）進(jìn)行擠出并重復(fù)22次。通過Microcon-30kDa離心過濾裝置（EMDMillipore，美國）以4000g離心15min純化RFN。使用相同的方法制備Dio和Dil標(biāo)記的RFN。

（三）藥物裝載

通過共孵育法將RIF裝載到MSN中。簡而言之，RIF以5mg?mL-1的濃度溶解在甲醇中，并與濃度為10mg?mL-1的MSN一起孵育30min，在4℃下10000g離心15min獲得裝載RIF的MSN，收集上清液，采用分光光度法測定未裝載的RIF的濃度，將已裝載RIF但未進(jìn)行磷脂涂覆的MSN定義為NP。

（四）體外藥物釋放

將含有500μgRIF的NP和RFN在1mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中于37℃下孵育，然后通過Microcon-10kDa離心過濾裝置在4000g、4℃條件下離心15min。為了研究PLC觸發(fā)的藥物釋放，將1unit?mL-1的PLC與樣品一起孵育。D609（1μmol?L-1）是一種特異性PLC抑制劑，用于抑制PLC酶活性。通過使用多功能酶標(biāo)儀（InfiniteMPlex,Tecan，瑞士）在474nm處測量上清液的吸光度來測定釋放的RIF的濃度。納米顆粒放置于培養(yǎng)箱中，在每個時間點(diǎn)（0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、16h和24h）取樣檢測釋放。

（五）殺菌曲線

蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus,

B.cereus）MHI241在腦心浸出液肉湯中培養(yǎng)過夜，37℃、200r?min-1條件下振蕩以達(dá)到指數(shù)生長期。將微生物溶液的濃度調(diào)整為麥?zhǔn)蠞岫?.5，然后將該溶液進(jìn)一步稀釋10倍。細(xì)菌懸液中加入RIF（1.25μg???mL-1）、NP（40μg???mL-1）或RFN（160μg???mL-1），濃度相當(dāng)于最小抑制濃度（MIC）的10倍。在37℃下?lián)u動（200r?min-1）孵育，在預(yù)定時間點(diǎn)（0h、2h、4h、8h和24h）從每個孔中取出細(xì)菌樣品，進(jìn)行一系列稀釋，將稀釋的細(xì)菌懸液（100μL）均勻涂在胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）平板上，繼續(xù)在37℃下孵育16~20h。進(jìn)行菌落計數(shù)并計算每毫升的菌落形成單位（CFU?mL-1）。

（六）細(xì)胞培養(yǎng)

將哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%熱滅活胎牛血清（FBS;Invitrogen，美國）和1%（濃度）青霉素-鏈霉素（Sigma-Aldrich，美國）的改良培養(yǎng)基（Dulbecco’smodifiedEagle’smedium,DMEM;Gibco，美國）中，培養(yǎng)于溫度37℃和含有5%CO2

的濕潤條件下。

（七）細(xì)胞內(nèi)分布

在24孔板中的14mm圓形蓋玻片上接種5×105個細(xì)胞，生長至70%~80%融合度時，加入NP或RFN（50μg?mL-1）在37℃和5%CO2中孵育1h。孵育后，用PBS洗滌細(xì)胞三次，以去除未被吸收的納米顆粒。將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定10min，采用PBS洗滌5min，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和ActinGreen488試劑（高親和力F-actin探針）染色。加入抗淬滅劑后，在載玻片上覆蓋蓋玻片，干燥并避光保存，直到用LeicaTCSSP8共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM，德國）進(jìn)行成像檢查。

RAW264.7細(xì)胞用RFN（50μg?mL-1）和熒光標(biāo)記的B.cereus

[感染復(fù)數(shù)（MOI）=40]處理，并在37℃和5%CO2下孵育2h。孵育完成后，用PBS（pH=7.4）洗滌細(xì)胞三次，以去除未被吸收的納米顆粒和細(xì)菌。用LysoTrackerDeepRed（50nmol·L-1,Invitrogen）對細(xì)胞進(jìn)行染色。樣品避光保存，直到用CLSM進(jìn)行檢查。

（八）PG調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取

制備含有不同磷脂成分（PG百分比：0、20%、40%、60%、80%和100%）的RFN以調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取。將由納米顆粒處理的RAW264.7細(xì)胞在37℃和5%CO2中孵育1h。孵育后，用PBS洗滌三次，以去除未被吸收的顆粒，將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定10min，然后再用PBS洗滌三次。細(xì)胞用DAPI和ActinGreen488試劑進(jìn)行染色并通過CLSM觀察。

（九）細(xì)胞攝取途徑

將RAW264.7細(xì)胞與RFN（50μg?mL-1）和熒光標(biāo)記的B.cereus（MOI=40）共同處理，分別在37℃和5%CO2中孵育0.5h和1h。孵育后，用PBS（pH=7.4）洗滌三次，以去除未被吸收的RFN和細(xì)菌。通過免疫熒光檢測細(xì)胞中的早期和晚期內(nèi)體。一抗包括兔抗Rab7和鼠抗EEA1抗體（Abcam，英國），二抗是山羊抗兔和山羊抗鼠抗體（碧云天生物技術(shù)公司），制備的樣品避光保存，采用CLSM檢測。

（十）體外抗菌試驗

蠟樣芽胞桿菌用pHrodoRed（LifeTechnologies，美國）在37℃條件下染色15min，以MOI=40感染RAW264.7細(xì)胞，同時加入10倍MIC的RIF、NP或RFN在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4h，然后用100μg?mL-1慶大霉素處理后，用PBS（pH=7.4）洗滌三次。將細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定10min，再加入含有0.1%TritonX-100的PBS（pH=7.4）透化細(xì)胞10min，樣品用DAPI和ActinGreen488染色，用CLSM進(jìn)行熒光測定。

B.cereus（MOI=40）感染RAW264.7細(xì)胞，然后用10倍MIC的RIF、NP或RFN處理4h。慶大霉素（100μg?mL-1）用于殺死胞外細(xì)菌，用PBS洗滌三次后，加入1%TritonX-100裂解細(xì)胞2min，將稀釋的裂解液（100μL）涂在TSA平板上，在37℃下孵育16~20h。進(jìn)行菌落計數(shù)計算每毫升的菌落形成單位。

（十一）道德聲明

所有動物試驗操作均按照中華人民共和國國務(wù)院批準(zhǔn)的《實(shí)驗動物管理條例》（發(fā)布日期：1988年11月14日）進(jìn)行。實(shí)驗方案和細(xì)節(jié)得到了中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗動物管理和使用委員會（IACUC）的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：AW50301202-2-1）。雄性Wistar大鼠（5周齡）和雌性BALB/c小鼠（18~20g）被飼養(yǎng)在受控的12h光照/12h黑暗循環(huán)的環(huán)境中，并且給大鼠和小鼠提供充足的食物和水。環(huán)境保持在恒定溫度(23±2)℃和濕度（60%±5%）條件下。

（十二）大鼠皮膚傷口感染模型

為了評估RFN對臨床分離株MRSAT144的治療效果，使用大鼠皮膚傷口感染模型。大鼠通過腹腔（i.p.）注射水合氯醛（0.5mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%）進(jìn)行麻醉，并在手術(shù)前用酒精（體積分?jǐn)?shù)為75%）擦拭消毒背部皮膚，小心地去除每只大鼠背部的皮毛，并造成直徑1cm的全層傷口，在傷口處加入50μLPBS（pH=7.4）菌懸液（每個傷口1×108

CFU）進(jìn)行感染。將所有動物分為4組：PBS（pH=7.4）、萬古霉素（Van;5mg?kg-1）、NP（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF）和RFN（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF)。在治療后的不同時間點(diǎn)（0d、3d、6d、9d和13d）測試傷口的大小和細(xì)菌載量，收集傷口組織于-20℃下儲存，最后將傷口組織加入1mL無菌PBS均質(zhì)，對獲得的勻漿液進(jìn)行10倍系列稀釋，然后接種在S.aureus顯色瓊脂培養(yǎng)基（CHROMagar，法國）中，37℃下孵育16~20h。此外，記錄所有動物的體重和傷口完全愈合時間。在第3天采集大鼠血清于-80℃儲存，使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）分析腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的濃度。第13天，切除傷口組織并固定在4%多聚甲醛固定液，然后將所有組織包埋在石蠟中，制備4μm切片用于傳統(tǒng)的蘇木精和伊紅（H&E）和Masson染色。

（十三）小鼠菌血癥模型

雌性BALB/c小鼠被隨機(jī)分為4組：PBS（pH=7.4）、Van（5mg?kg-1）、NP（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF）和RFN（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF）。通過尾靜脈注射100μLPBS菌懸液（7.5×107

CFU），感染后1h通過靜脈注射對小鼠進(jìn)行治療。連續(xù)監(jiān)測小鼠48h，一旦小鼠死亡，立即收集其心臟、肝臟、脾、肺和腎臟組織并儲存在-20℃條件下。存活的小鼠在48h后通過頸椎脫臼法安樂死，然后收集不同的器官。在1mL無菌PBS中制備器官勻漿液并連續(xù)稀釋，然后均勻涂覆在S.aureus顯色瓊脂培養(yǎng)基上，37℃下孵育16~20h。測定不同器官中的細(xì)菌載量并計算各組生存率。

（十四）統(tǒng)計數(shù)據(jù)

使用GraphPadPrism7.0確定統(tǒng)計顯著性，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。所有P值的計算均使用非配對t檢驗或單向方差分析（ANOVA）和其他特殊分析方法。

三、結(jié)果（一）RFN表現(xiàn)出高選擇性和有效性

通過MSN表面功能化修飾來制造帶有可生物降解磷脂涂層的RFN，從而主動識別磷脂酶陽性細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)以按需方式釋放抗生素，最終精準(zhǔn)殺傷目標(biāo)病原菌[圖2（a）]。基于掃描電子顯微鏡（SEM）和動態(tài)光散射（DLS）分析，發(fā)現(xiàn)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作為致孔劑可成功誘導(dǎo)微孔結(jié)構(gòu)，獲得了具有高分散性和球形均勻的MSN[圖2（b）、（c）]。通過透射電子顯微鏡[TEM；圖2（b）]進(jìn)一步觀察到MSN具有微小孔徑，并通過氮?dú)猓∟2）吸附-脫附技術(shù)測得孔徑大小為3.8nm[圖2（c）、（d）]。MSN的密度泛函理論（DFT）表面積和孔體積分別為490.2m2?g-1和0.92cm3?g-1

[圖2（e）]，表明形成了微孔結(jié)構(gòu)。同時，優(yōu)化CTAB的濃度獲得具有適當(dāng)粒徑大?。?30nm）和最高RIF負(fù)載量（9.7%±0.9%）的MSN。此外通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析了RFN中的CTAB殘留量為67.1ng?mg-1，滿足后續(xù)實(shí)驗要求。圖2.

RFN以高選擇性方式有效殺傷磷脂酶陽性細(xì)菌。（a）RFN高選擇性殺滅多重耐藥細(xì)菌示意圖。（b）涂有磷脂的RFN和MSN的代表性圖像。箭頭表示磷脂涂層。比例尺：100nm。（c）使用動態(tài)光散射確定涂覆磷脂后RFN尺寸的增加。氮?dú)馕?解吸等溫線（d）和MSN的相應(yīng)孔徑分布（e）。（f）RIF在不同條件下的吸收光譜，波長為474nm時最大。（g）磷脂酶C引起RIF從RFN中特異性釋放并且可以被D609抑制，其中D609是磷脂酶C的特異性抑制劑。（h）10倍MIC的RIF、NP和RFN處理指數(shù)生長期的蠟樣芽孢桿菌的殺菌動力學(xué)。

為了將磷脂涂覆在MSN表面，使用水合/擠出法通過非共價鍵作用方式將磷脂包覆在MSN表面。MSN被PG和PC包裹形成了具有磷脂酶響應(yīng)性的RFN用于控制藥物釋放。PG和PC按8∶2的質(zhì)量比混合，有效防止藥物泄漏以及在血液循環(huán)期間保持生物相容性。通過TEM觀察到RFN具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)[見圖2（b）]，表明磷脂成功轉(zhuǎn)移到MSN表面。此外，磷脂雙層涂覆后，MSN的粒徑增加，也表明磷脂包封成功。在474nm處觀察到RIF成功加載到RFN中[圖2（f）]，并使用傅里葉變換紅外光譜的特征吸收進(jìn)行了確認(rèn)。最后觀察到RFN在-80℃保存長達(dá)30d后依然具有穩(wěn)定的流體動力學(xué)直徑和表面zeta電位。

假設(shè)由細(xì)菌衍生的磷脂酶催化的磷脂水解可能導(dǎo)致RFN中的孔結(jié)構(gòu)暴露，從而釋放負(fù)載的抗菌藥物。為了評價磷脂酶響應(yīng)性RFN的抗菌效率，首先使用B.cereus來源的PLC和S.aureus來源的PLA2評估了RFN在體外釋放試驗中的響應(yīng)性。孵育24h后，與無磷脂酶條件下僅釋放20%RIF相比，在PLC存在下超過60%RIF從RFN中釋放[圖2（g）]。而在特異性PLC抑制劑[1μmol?L-1,D609；圖2（g）]存在下，RIF釋放度降低。這一結(jié)果提示RFN持續(xù)釋放RIF可通過延長作用時間從而提高治療效果。不同的藥物釋放動力學(xué)也表明RFN孔結(jié)構(gòu)被磷脂涂層覆蓋，這與TEM觀察到的核殼結(jié)構(gòu)一致[圖2（b）]。另外，RFN孵育8h后可以減少99.9%的B.cereus

[見圖2（g）]，并且對MRSA也表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗菌活性，表明涂層被磷脂酶破壞，從而加速了RIF從RFN中的釋放。總的來說，這些結(jié)果表明RFN對磷脂酶陽性細(xì)菌高度敏感，可作為有效的藥物遞送系統(tǒng)來提升抗菌藥物的選擇性和抗菌效率。

（二）RFN通過調(diào)整磷脂成分靶向溶酶體

由于抗菌藥物進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力差，限制了其對胞質(zhì)細(xì)菌的治療效果?？咕幬镌诓溉閯游锛?xì)胞中的分布對殺傷胞質(zhì)細(xì)菌起關(guān)鍵作用。文章探究了RFN進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的途徑及其靶點(diǎn)，闡明了含有不同磷脂成分的RFN在RAW264.7細(xì)胞中的分布規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒的化學(xué)成分和表面特性對其細(xì)胞攝取、胞內(nèi)分布和治療效果至關(guān)重要。RFN表面的PG/PC含量顯著影響了RFN的細(xì)胞內(nèi)分布[見圖3（a）]。含有80%PC的RFN在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)廣泛分布狀態(tài)，表明涂層中的高PC含量會導(dǎo)致納米顆粒從溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。相反，含有20%PC的RFN則在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布狀態(tài)，表明RFN可能被困在溶酶體中。值得注意的是，在肺癌細(xì)胞A549中也觀察到了類似的趨勢。同時，RFN在溶酶體中累積的增加與PG/PC含量呈劑量依賴性[圖3（b）]。帶正電荷的磷脂和人源磷脂降低了RFN在溶酶體中的累積，這與之前報道的由正電荷引發(fā)的內(nèi)體膜不穩(wěn)定的研究結(jié)果一致。然而，尚不清楚磷脂的相變溫度是否參與了它們的分布調(diào)節(jié)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明可以通過改變磷脂成分來精確調(diào)節(jié)RFN的亞細(xì)胞分布，并且高PG/PC比率有助于靶向溶酶體過程。圖3.

不同PG/PC含量調(diào)節(jié)RFN的細(xì)胞攝取。（a）磷脂PG/PC的比例增加介導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中RFN的點(diǎn)狀分布。RFN與RAW264.7細(xì)胞孵育1h的代表性共聚焦圖像。細(xì)胞用DAPI（藍(lán)色）和肌動蛋白綠488（ActinGreen488）（綠色）染色。比例尺：10μm。（b）用PG/PC含量增加的RFN處理RAW264.7細(xì)胞后觀察到每個細(xì)胞的點(diǎn)數(shù)增加。（c）用RFN（50μg?mL-1）和蠟樣芽孢桿菌MHI241[感染復(fù)數(shù)（MOI）=40]處理2h的RAW264.7細(xì)胞的代表性圖像。溶酶體（紅色）、細(xì)菌（藍(lán)色）和RFN（綠色）共定位。比例尺：8μm。（d）、（e）用RFN（50μg?mL-1）（d）和蠟樣芽孢桿菌MHI241（MOI=40）（e）處理RAW264.7細(xì)胞0.5h和1h。細(xì)胞用EEA1（早期內(nèi)體）和Rab7（晚期內(nèi)體）的特異性抗體染色。比例尺：10μm。（f）RFN通過靶向亞細(xì)胞區(qū)室來殺滅胞質(zhì)細(xì)菌。

鑒于許多胞質(zhì)細(xì)菌病原體最終被困在溶酶體中，因此提高抗菌藥物在溶酶體中的累積對于殺傷胞質(zhì)細(xì)菌病原體至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)RFN可與細(xì)菌和溶酶體共定位，表明RFN和細(xì)菌定位在同一個亞細(xì)胞區(qū)室中[圖3（c）]，并且可以借助細(xì)菌分泌的磷脂酶有效水解RFN涂層以激活抗菌藥物釋放，達(dá)到高效殺傷細(xì)菌病原體的目的。此外，基于PC與B.cereus細(xì)胞壁中的主要成分磷壁酸之間的靜電相互作用，觀察到RFN（綠色）與B.cereus（藍(lán)色）的廣泛結(jié)合[圖3（c）]。含有高PG/PC比率的RFN不僅可以靶向溶酶體，還可以捕獲亞細(xì)胞區(qū)室中的細(xì)菌病原體。為了進(jìn)一步確定RFN的細(xì)胞攝取途徑，在B.cereus感染期間對RFN進(jìn)行胞質(zhì)可視化定位，采用內(nèi)體標(biāo)記技術(shù)對感染B.cereus的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行染色。處理1h后，發(fā)現(xiàn)RFN和B.cereus與早晚期內(nèi)體共定位[圖3（d）、（e）]，表明RFN和細(xì)菌可能通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，這與大多數(shù)聚合物納米顆粒的內(nèi)化作用一致。在S.aureus模型中也觀察到類似的結(jié)果，表明RFN潛在的可行性和多功能性。綜上所述，成功制備一種易于調(diào)節(jié)的藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有抗菌藥物重分布從而靶向胞質(zhì)細(xì)菌病原體的潛力[圖3（f）]。

（三）RFN體外高抗菌療效

宿主細(xì)胞內(nèi)存活的細(xì)菌病原體可以使這些感染的細(xì)胞充當(dāng)“特洛伊木馬”，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)。鑒于RFN具有將抗菌藥物遞送到宿主細(xì)胞中的獨(dú)特能力，進(jìn)一步研究了RFN對胞質(zhì)B.cereus和S.aureus的抗菌效果。結(jié)果表明，RFN有效減少了RAW264.7胞質(zhì)B.cereus的數(shù)量[見圖4（a）]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同樣處理4h，RFN組細(xì)胞中B.cereus的數(shù)量約是RIF組的數(shù)量的1%[圖4（b）]。RFN有效殺傷胞質(zhì)細(xì)菌的效果在S.aureus模型中也得到證實(shí)，這可歸因于抗菌藥物靶向遞送。因此RFN通過靶向亞細(xì)胞區(qū)室方式展示出其對抗胞質(zhì)細(xì)菌感染的潛力。

圖4.

RFN在體外有效殺傷胞質(zhì)MDR細(xì)菌。（a）感染蠟樣芽孢桿菌（紅色）的RAW264.7細(xì)胞在用RIF、NP或RFN處理4h后的共聚焦圖像。細(xì)胞核（藍(lán)色）和肌動蛋白（綠色）分別用DAPI和肌動蛋白綠488染色。比例尺：10μm。（b）10倍MIC藥物處理RAW264.7細(xì)胞4h后的胞質(zhì)細(xì)菌載量。（c）用不同濃度RFN（0μg?mL-1、16μg?mL-1、32μg?mL-1、64μg?mL-1、128μg?mL-1和256μg?mL-1）處理的蠟樣芽孢桿菌中耗散的膜電位，用DiSC3(5)（622nm/670nm的激發(fā)/發(fā)射波長）染色。（d）RFN處理的蠟樣芽孢桿菌中三磷酸腺苷（ATP）的細(xì)胞內(nèi)積累減少。（e）RFN處理后，通過測量2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（激發(fā)/發(fā)射波長為488nm/525nm）的熒光強(qiáng)度來確定蠟樣芽孢桿菌中活性氧（ROS）的累積。

鑒于RFN具有殺傷胞質(zhì)細(xì)菌病原體的潛力，測試了經(jīng)RFN處理的B.cereus的生化變化，觀察到膜通透性呈劑量依賴性增加和細(xì)胞內(nèi)大分子的釋放，如β-半乳糖苷酶（Mw

=130kDa）和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）。進(jìn)一步分析膜去極化，結(jié)果顯示，在RFN處理后B.cereus膜電位的耗散呈現(xiàn)劑量依賴性增加[圖4（c）]，膜電位的去極化會損害膜上發(fā)生重要生化反應(yīng)，包括細(xì)菌中ATP的產(chǎn)生。因此測定了細(xì)胞內(nèi)ATP的累積。RFN治療果然導(dǎo)致了B.cereus細(xì)胞內(nèi)ATP減少[圖4（d）]。此外，內(nèi)源性活性氧（ROS）的累積對細(xì)菌清除至關(guān)重要，本研究觀察到B.cereus中ROS累積隨著RFN濃度的升高而增加[圖4（e）]?？傊?，這些結(jié)果說明膜損傷和氧化損傷對于RFN抗菌活性至關(guān)重要。

（四）RFN有效對抗動物體內(nèi)MRSA感染

為了確定RFN在體內(nèi)對抗細(xì)菌感染的能力，使用由MRSAT144感染的兩種動物模型評估了其治療潛力[圖5（a）]。在藥效學(xué)評估之前，測試了RFN對細(xì)胞活力和溶血率的影響，發(fā)現(xiàn)即使在500μg?mL-1的濃度下，RFN也表現(xiàn)出良好的生物相容性，這是在體內(nèi)無法達(dá)到的耐受劑量。根據(jù)之前報道的方法，大鼠皮膚傷口感染MRSAT144（每個傷口108

CFU），并在感染后1h對受傷部位進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)用RFN（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF）治療的感染傷口在13d內(nèi)幾乎100%愈合[圖5（b）、（c）]，而Van組（5mg?kg-1）治愈率僅為75%。在臨床上，Van一直被用作治療MRSA感染的金標(biāo)準(zhǔn)。已有研究報道了抗體偶聯(lián)物對抗MRSA感染比Van更有效，主要是由于Van對胞質(zhì)細(xì)菌的療效不佳。RFN促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗菌藥物的累積，從而殺傷更多的MRSA并加速傷口愈合[圖5（d）]。以上結(jié)果表明，RFN在對抗MRSA感染和促進(jìn)傷口愈合方面更有效。

圖5.

RFN在MRSA感染的兩種動物模型中顯示高療效。（a）大鼠皮膚傷口感染模型和小鼠菌血癥模型的實(shí)驗方案示意圖。（b）用Van（5mg?kg-1）、NP或RFN（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF）治療MRSAT144（每個傷口108

CFU）感染的傷口代表性照片。比例尺：1cm。（c）處理后第3、6、9和13天的傷口愈合大小。（d）大鼠傷口感染模型中的細(xì)菌載量。在感染后第13天發(fā)現(xiàn)RFN治療的感染傷口中細(xì)菌載量減少。（e）傷口皮膚H&E和Masson染色的代表性顯微照片。箭頭表示表皮。比例尺：100μm。（f）RFN治療傷口的上皮間隙增加。（g）靜脈注射MRSAT144（7.5×107

CFU）建立菌血癥小鼠模型，用Van（5mg?kg-1）、NP或RFN（相當(dāng)于2mg?kg-1

RIF）治療后的小鼠存活曲線。（h）對兩個腎臟中的MRSAT144進(jìn)行定量分析。用RFN治療2d后，腎臟中的細(xì)菌載荷顯著降低。

為了進(jìn)一步評估RFN在促進(jìn)傷口愈合過程中的作用，在第13天使用H&E和Masson三色染色對傷口進(jìn)行組織學(xué)檢查，RFN可以顯著增加上皮間隙厚度以促進(jìn)傷口再上皮化[圖5（e）、（f）]。此外，通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重組，RFN治療組中膠原沉積增加，加速了再上皮化和組織重塑[圖5（e）]。這些結(jié)果與促進(jìn)傷口愈合過程中急性傷口的生理恢復(fù)和再生一致。與PBS治療相比，RFN治療后創(chuàng)面閉合時間顯著縮短了三天，第13天體重明顯增加，進(jìn)一步證明了RFN具有更好的創(chuàng)傷愈合能力和效率。與模型組相比，局部RFN治療后炎癥因