霍亂弧菌檢測(cè)

關(guān)于霍亂弧菌檢測(cè)學(xué)習(xí)要點(diǎn)：霍亂弧菌概述與分類(lèi)霍亂弧菌的標(biāo)本采集霍亂弧菌的分離培養(yǎng)霍亂弧菌的鑒定第2頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天霍亂弧菌（V.cholera）是人類(lèi)霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大流行。典型臨床表現(xiàn)：劇烈的嘔吐、腹瀉（無(wú)痛性）

、米泔水樣便、脫水，死亡率甚高。屬于國(guó)際檢疫的烈性傳染病。一、概述第3頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天大便≈小便第4頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天病原學(xué)形態(tài)：霍亂弧菌屬于弧菌科弧菌屬，革蘭染色陰性菌體短小，稍彎曲，兩端鈍圓，長(zhǎng)1.5～2.0μm,寬0.3～0.4μm。菌體尾端有單鞭毛，運(yùn)動(dòng)極為活潑，在暗視野顯微鏡下呈流星樣運(yùn)動(dòng)，培養(yǎng)溫度以37℃為最適宜，在堿性（PH8.8～9.0）肉湯（或蛋白胨）培養(yǎng)基上易于生長(zhǎng)（耐堿怕酸）

第5頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天革蘭染色鞭毛染色霍亂弧菌涂片、染色第6頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成200個(gè)血清群。根據(jù)是否與O1抗血清凝集分兩大群，

O1群霍亂弧菌：凡能與O1群抗血清發(fā)生凝集非O1群霍亂弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。分群與分型第7頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、古典生物型（前6次大流行）2、E1Tor生物型（第7次1961年來(lái)）。兩個(gè)生物型具有相同的血清型。我國(guó)流行以ElTor霍亂弧菌為主。O1群霍亂弧菌的生物型第9頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天古典生物型與El-Tor生物型區(qū)別特征古典生物型El-Tor生物型羊紅細(xì)胞溶血-D雞紅細(xì)胞凝集-+V-P試驗(yàn)-+多粘菌素B敏感試驗(yàn)+-IV組噬菌體裂解+-V組噬菌體裂解-+第10頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天

O1群霍亂弧菌的血清分型及抗原成份型別別名O抗原成份原型稻葉型（Inaba）A、C異型小川型（Ogawa）A、B（少量C）中間型彥島型（Hikojima）A、B、C第11頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天O139群霍亂弧菌1992年，在印度印度馬德拉斯、泰米爾納德發(fā)生的霍亂疫情，分離到的菌株不與O1群霍亂血清凝集，但是引起O1群霍亂的典型癥狀。引起WHO重視，定為O139群霍亂弧菌，被認(rèn)為下一次霍亂大流行主角。非O1群霍亂弧菌（O139霍亂）第12頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天生化特征與O1菌基本相同。含有與O1群霍亂弧菌相同毒力基因除O抗原不同外，其它性狀均與EL-Tor生物型相似。毒力蛋白及其調(diào)控因子與El-Tor霍亂具有高度同源的編碼。O139霍亂弧菌菌可以產(chǎn)生莢膜與O1群霍亂無(wú)交叉免疫力環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)耐藥性強(qiáng)O139群霍亂弧菌的生物學(xué)特征第13頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、標(biāo)本的采集與送檢概述：標(biāo)本采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標(biāo)本：食物、水、環(huán)境類(lèi)樣品……

監(jiān)測(cè)：水樣，水產(chǎn)品等標(biāo)本運(yùn)送：一般要求在6小時(shí)內(nèi)室溫（20-25℃）條件下送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，

C-B運(yùn)輸培養(yǎng)基（pH8.4）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（pH8.4-9.2）

：培養(yǎng)基質(zhì)量的保證：堿性胨水要澄清透明（表明未長(zhǎng)細(xì)菌）、8-10ml量要足。不符合規(guī)定，立即通知相關(guān)實(shí)驗(yàn)室或CDC更換。便量合適：不要太少，不能太多（改變培養(yǎng)基的pH）。送檢及時(shí)：6h內(nèi)送檢。第14頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、糞便標(biāo)本（1）采樣逢疑必采應(yīng)在發(fā)病早期，服用抗菌藥物之前完成，并盡快送到檢驗(yàn)室。糞便標(biāo)本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鮮大便，也可用直腸棉拭或采便管由肛門(mén)插入直腸內(nèi)3cm-5cm處采取，水樣便采取1ml-3ml，成型便采取指甲蓋大小的糞便量。病人的嘔吐物，沾染糞便的衣服和用具，也可作為檢材。第15頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意！因腹瀉病因復(fù)雜，霍亂輕型病例的癥狀與體征很不明顯，不易與其他病因引起的腹瀉相區(qū)別。因此，霍亂流行季節(jié)，逢瀉必采是必須遵守的原則第16頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）送檢劇烈腹瀉病人的水樣便含有大量病菌，直接分離培養(yǎng)不難檢出陽(yáng)性。條件允許的醫(yī)院，通知實(shí)驗(yàn)室人員直接水樣便接種四號(hào)平板培養(yǎng)?？s短檢測(cè)時(shí)間。不能立即檢查的，要接種于培養(yǎng)基內(nèi)，盡快送往檢驗(yàn)室。送檢標(biāo)本可放入（PH8.6-9.0）堿性蛋白胨水（不是最佳的，尤其6小時(shí)內(nèi)還不能進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，盡量采用C-B運(yùn)輸培養(yǎng)基。），也可放入文—臘二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基中。第17頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天水體的采樣一般要求用滅菌的500ml水樣瓶采集相對(duì)靜止的表層水（水面30cm以?xún)?nèi)）450ml，加蓋密封后快速送檢。取水點(diǎn)的選擇應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查等資料確定，同時(shí)，采樣時(shí)應(yīng)選擇在水流平穩(wěn)或靜止處吸取。非疫情狀態(tài)下的監(jiān)測(cè)采樣時(shí)間一般在清晨時(shí)，此時(shí)水體未受人群活動(dòng)等因素影響。2、水樣標(biāo)本第18頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天水生動(dòng)物的采樣通常選取活的或新鮮的水生動(dòng)物為采集對(duì)象，有時(shí)也應(yīng)考慮冰凍的水生動(dòng)物，以無(wú)菌操作采集合適的部位，如鰓部和/或腸內(nèi)容物等，置采樣瓶（管）或食品采樣袋密封，在常溫下送檢。有條件的采樣點(diǎn)可將水生動(dòng)物整體采回實(shí)驗(yàn)室再進(jìn)行相關(guān)處置。同時(shí)，要求以無(wú)菌棉簽涂抹五只（條）以上的某類(lèi)水生動(dòng)物體表、鰓及/或肛門(mén)，置堿性蛋白胨水送檢，每管堿性蛋白胨水作一份樣品看待。3、生物標(biāo)本第19頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天增菌：堿性蛋白胨水（pH8.6）作為增菌液；分離：強(qiáng)選擇性分離培養(yǎng)基（慶大霉素培養(yǎng)基或TCBS培養(yǎng)基或4號(hào)培養(yǎng)基）分離；弱選擇性培養(yǎng)基使用堿性瓊脂或堿性膽鹽瓊脂。應(yīng)注意不同廠(chǎng)商以及不同批號(hào)培養(yǎng)基的質(zhì)量，每批培養(yǎng)基在使用前必須進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。三、霍亂弧菌的培養(yǎng)分離第20頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時(shí)劃線(xiàn)分離選擇性平板（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時(shí)，沾取菌膜下表層液體，劃線(xiàn)分離選擇性平板（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時(shí)吸取0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時(shí)后劃線(xiàn)分離選擇性平板（慶大／四號(hào)／ＴＣＢＳ平板，第三板）。分離培養(yǎng)要點(diǎn)（兩管三板法）：第21頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天

經(jīng)典的鑒定步驟要求每個(gè)平板應(yīng)挑取5個(gè)以上可疑菌落,轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面待分純培養(yǎng)后,再進(jìn)行O1、O139群血清玻片凝集試驗(yàn)，鑒于對(duì)霍亂疫情應(yīng)急處理的考慮,現(xiàn)大多數(shù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室一般采用將血清玻片凝集試驗(yàn)前置的做法,作為快速篩查的手段,直接對(duì)平板上生長(zhǎng)的單個(gè)可疑菌落進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn),出現(xiàn)明顯凝集時(shí)可做初步報(bào)告,對(duì)平板上出現(xiàn)可疑凝集的菌株必須馬上轉(zhuǎn)種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養(yǎng)物生長(zhǎng)良好后再次進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)加以確證。

慶大霉素平板和4號(hào)瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加深（由于這類(lèi)培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成份）。

TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長(zhǎng)呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤(rùn)濕、稍凸起、邊緣整齊。（TCBS平板生長(zhǎng)的菌落不能直挑取進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，需按經(jīng)典方法進(jìn)行純培養(yǎng)后再進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)）

可疑菌落的挑取第23頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天4號(hào)平板第24頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天TCBS平板培養(yǎng)菌落形態(tài)（呈黃色）第25頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天染色鏡檢革蘭染色陰性的短桿菌血清凝集試驗(yàn)：

分別使用O1群，O139群霍亂血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，同時(shí)使用生理鹽水進(jìn)行對(duì)照凝集，以排除與生理鹽水發(fā)生凝集的自凝菌。

生理鹽水不凝集，O1群血清明顯凝集的菌落，進(jìn)一步使用稻葉型和小川型血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現(xiàn)凝集的時(shí)候，要注意鑒別是否為彥島型，需進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)且兩者的凝集效價(jià)均超過(guò)一半以上才能判定為彥島型，因?yàn)槟承┬〈ㄐ途渥陨頃?huì)帶有少量的C抗原而出現(xiàn)與稻葉型血清發(fā)生弱凝集，因此如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優(yōu)勢(shì)時(shí)應(yīng)維持小川型的判定。

生理鹽水不凝集，O139群血清明顯凝集的菌落，一般為O139群，但其與O22群及O155群甚至一些非霍亂弧菌會(huì)出現(xiàn)交叉凝集，由上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)合菌落特征和菌體形態(tài)，作出初步報(bào)告。必須注意同一樣品中O1、O139群霍亂弧菌可能同時(shí)存在，有必要對(duì)所有選出的菌株都進(jìn)行凝集試驗(yàn)，以免遺漏。四、霍亂弧菌鑒定-玻片凝集第26頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天霍亂弧菌的血清學(xué)鑒定要點(diǎn)9cm平板，1劃1，嚴(yán)禁1劃2。純培養(yǎng)做血清學(xué)鑒定。凝集，肉眼可見(jiàn)大顆粒。不要誤判。血清學(xué)凝集同時(shí)做鹽水凝集對(duì)照，自凝菌排除。血清學(xué)凝集覆蓋O1與O139?；魜y弧菌鑒定，以血清學(xué)為主，血清學(xué)凝集陽(yáng)性即可初步報(bào)告。區(qū)別于腸桿菌科細(xì)菌（生化報(bào)告）。第27頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)1％鹽酸對(duì)氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液

粘絲試驗(yàn)0.5％去氧膽酸鈉水溶液

第28頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)生化鑒定

生化鑒定管：發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能分解色氨酸賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）

霍亂弧菌生化鑒定管（11種生化,套裝，環(huán)凱）；

生化鑒定條：梅里埃API20E鑒定條等

全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)：梅里埃VITEK2COMP全自動(dòng)生化鑒定卡等進(jìn)一步分型鑒定(省CDC進(jìn)行)

噬菌體分型

PFGE脈沖場(chǎng)分型第29頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天快速檢測(cè)試劑盒1熒光PCR

O1群、O139群雙色熒光檢測(cè)試劑盒霍亂CTX毒力基因熒光檢測(cè)試劑盒2膠體金技術(shù)第30頁(yè),