生物工程導(dǎo)論及生物工程概論復(fù)習(xí)題

PAGEPAGE44第一章緒論生物工程是生命科學(xué)和工程科學(xué)的交叉科學(xué)。生物工程學(xué)科的任務(wù)是促進(jìn)和實(shí)現(xiàn)生命科學(xué)的實(shí)驗(yàn)室研究成果向應(yīng)用領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化。1.1生物工程的學(xué)科基礎(chǔ)以生物科學(xué)和生物技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合化學(xué)工程、機(jī)械工程、控制工程、環(huán)境工程等工程學(xué)科，研究和發(fā)展利用生物體系或其中的一部分生產(chǎn)有益于社會(huì)的產(chǎn)品或達(dá)到一定社會(huì)目標(biāo)的過程工程科學(xué)。生物工程的研究對(duì)象包括活的生物體或它們的一部分。生物工程的任務(wù)就是為細(xì)胞的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物積累創(chuàng)造最好的條件，研究開發(fā)最適合的工藝路線和設(shè)備，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以滿足社會(huì)需要。1.2生物工程的研究領(lǐng)域生物工程的研究領(lǐng)域包括：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、微生物工程（發(fā)酵工程）及生物分離工程。1.2.1基因工程DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，1967年第一個(gè)基因工程產(chǎn)品——人胰島素通過定位突變的方法使所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，根據(jù)需要設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)氨基酸序列，已經(jīng)發(fā)展成為一門新的交叉學(xué)科——蛋白質(zhì)工程。1.2.2細(xì)胞工程細(xì)胞是構(gòu)成包括人類、動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的幾乎所有生物的基本單元。哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞（即未分化的細(xì)胞）也具有全能性和無限繁殖的能力。發(fā)酵工程和生物分離技術(shù)的進(jìn)步則是提高細(xì)胞培養(yǎng)工程和目標(biāo)產(chǎn)物回收過程效率的可靠保障。1.2.3酶工程幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)，酶又具有催化劑的功能，即能夠降低化學(xué)反應(yīng)的活化能、加快反應(yīng)速率，在反應(yīng)中不消耗，反應(yīng)結(jié)束時(shí)恢復(fù)到原來的狀態(tài)。酶工程是研究酶的分離、提純及利用酶作為生物催化劑，實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化，合成各種產(chǎn)物或達(dá)到人類所需社會(huì)目標(biāo)的工程科學(xué)。酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)是很高的效率和專一性1.2.4發(fā)酵工程發(fā)酵工程已經(jīng)泛指所有細(xì)胞（動(dòng)物、植物、微生物及基因工程細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)并獲得目標(biāo)產(chǎn)物的過程。1.2.5生物分離工程與其他分離過程類似，生物技術(shù)產(chǎn)品的分離方法也是根據(jù)被分離對(duì)象及主要雜質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)設(shè)計(jì)分離提純流程，但是生物技術(shù)產(chǎn)品的分離也具有其特殊性，主要表現(xiàn)：(1)目標(biāo)產(chǎn)物的濃度低（2）目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)十分接近，而且成分非常復(fù)雜（3）目標(biāo)產(chǎn)物往往具有生物活性（4）在許多應(yīng)用領(lǐng)域，生物技術(shù)產(chǎn)品有很高的純度和安全性要求。第二章基因工程2.1概述2.1.1基因工程的誕生基因工程的誕生于1973年2.1.1.1理論上的三大發(fā)現(xiàn)（1）20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA1934年Avery（2）20世紀(jì)50年代提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1953年Watson和Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)（3）20世紀(jì)60年代確定了遺傳信息的傳遞方式1961年，Monod和Jacob提出每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一種氨基酸，1966年全部破譯了64個(gè)密碼，敘述了中心法則，提出遺傳信息流，即DNA→RNA→蛋白質(zhì)2.1.1.2技術(shù)上的三大發(fā)明(1)工具酶限制性核酸內(nèi)切酶稱為“剪刀”,把DNA連接酶比喻成“縫紉針線”(2)載體(3)逆轉(zhuǎn)錄酶1970年,Baltimore等人和Temin等人同時(shí)在各自的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。在完成以上三大理論發(fā)現(xiàn)和三大技術(shù)發(fā)明后，基因工程誕生的條件已經(jīng)成熟。1973年，斯坦福大學(xué)的Cohen等人進(jìn)行了另一個(gè)體外重組DNA實(shí)驗(yàn)并成功地發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這是人類歷史上第一次有目的地進(jìn)行基因重組實(shí)驗(yàn)，是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化的成功例子，1973年被許多科學(xué)家稱為基因工程元年。體外快速擴(kuò)增技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）2.1.2基因工程的內(nèi)容2.1.2.1基因工程的定義將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作過程稱為基因工程。基因工程的實(shí)施至少有四個(gè)必要條件：①工具酶②基因③載體④受體細(xì)胞基因工程也稱為基因克隆或DNA分子克隆2.2基因工程的理論基礎(chǔ)2.2.1DNA的結(jié)構(gòu)與功能基因工程的核心是重組DNA2.2.1.1DNA的組成核苷酸分子中有四種不同的堿基，即腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）2.2.1.2DNA結(jié)構(gòu)1953年Watson和Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，闡明了DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素有：氫鍵的形成、堿基的堆積力、磷酸基之間的靜電斥力、堿基分子內(nèi)能的作用等DNA復(fù)制有如下特點(diǎn)：①DNA的復(fù)制從特定的位點(diǎn)開始，這個(gè)位點(diǎn)稱為復(fù)制起始點(diǎn)，在復(fù)制起始點(diǎn)雙鏈DNA解旋，形成復(fù)制叉②半保留復(fù)制，每一雙鏈體都是由一條親鏈和一條新合成的子鏈組成③DNA的復(fù)制具有高度的忠實(shí)性④雖然DNA聚合酶是DNA復(fù)制的主酶。然而DNA復(fù)制是多種酶和蛋白因子協(xié)同有序工作的結(jié)果。DNA解旋酶的功能是在復(fù)制叉處使雙螺旋DNA解旋2.2.2DNA的變性、復(fù)性與雜交在加熱或某些試劑的作用下，DNA配對(duì)堿基之間的氫鍵結(jié)構(gòu)受到破壞，雙鏈DNA的多核苷酸鏈能完全分離，分離過程稱為變性或熔解。當(dāng)復(fù)性的DNA分子由不同的兩條單鏈分子形成時(shí)，稱為雜交。2.2.3遺傳信息的傳遞方向——中心法則DNA（基因）→RNA→蛋白質(zhì)（性狀）2.2.3.1RNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵一步，DNA分子中所儲(chǔ)存的遺傳信息，必須轉(zhuǎn)錄成信使RNA才能通過蛋白質(zhì)生物合成的過程轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)。2.2.3.2逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶以DNA為模板，在RNA聚合酶（依賴于DNA的RNA聚合酶）的催化下合成RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄，而將以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于DNA的RNA聚合酶）催化下合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。2.2.3.3翻譯——蛋白質(zhì)的生物合成翻譯就是將以核苷酸形式編碼在mRNA中的信息轉(zhuǎn)變成多肽鏈中特定的氨基酸順序。翻譯過程是非常復(fù)雜的生物反應(yīng)過程，需要大約200多種以上的生物大分子參與，包括核糖體、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成酶、各種可溶性的蛋白因子（起始因子、延伸因子、釋放因子）等參加并協(xié)同作用，從而完成蛋白質(zhì)的生物合成，體現(xiàn)了生物體的功能基因性狀。2.2.4基因的表達(dá)與調(diào)控基因根據(jù)功能不同分為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和操縱基因。2.3基因工程工具酶基因工程的操作，是分子水平上的操縱，它依賴于一些重要的酶作為工具來對(duì)基因進(jìn)行人工切割和拼接等操作。一般把這些切割DNA分子、進(jìn)行DNA片段修飾和DNA片段連接等所需的酶稱為工具酶。按用途分：①限制性內(nèi)切酶②連接酶③修飾酶識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特殊核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱限制酶。其他基因工程的工具酶：DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、T4多核苷酸酶和堿性磷酸酶等。2.4基因工程載體2.4.1基因工程載體的定義外源基因必須先同某種傳遞者結(jié)合后才能進(jìn)入細(xì)菌和動(dòng)植物受體細(xì)胞，這種能承載外源DNA片段（基因）并帶入受體細(xì)胞的傳遞者稱為基因工程載體。2.4.2用于原核生物宿主的載體2.4.2.1質(zhì)粒載體質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在。某些藍(lán)藻、綠藻和真菌細(xì)胞中也存在質(zhì)粒。2.4.2.3柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒是將λ噬菌體的粘性末端和大腸菌質(zhì)粒的抗氨芐西林素基因相連而獲得的人工載體,含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn),一個(gè)或多個(gè)限制酶切位點(diǎn)、一個(gè)cos片段和抗藥基因，能加入40~50kb的外源DNA，常用于構(gòu)建真核生物基因組文庫(kù)。2.4.4.1Ti質(zhì)粒2.4.5用于動(dòng)物宿主的載體2.4.5.1用于昆蟲細(xì)胞的載體桿狀病毒2.4.5.2用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體猿猴空泡病毒40（SV40）作為載體2.4.6基因工程載體的必備條件和簡(jiǎn)單分類必備條件能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞載體可以在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制要有篩選標(biāo)記對(duì)多種限制酶有單一或較少的切點(diǎn),最好是一個(gè)切點(diǎn)DNA重組使用的載體分類①克隆載體②穿梭載體③表達(dá)載體2.5目的基因的獲得基因是具有遺傳功能的DNA分子上的片段,平均長(zhǎng)度約1000bp。1975年Sanger等人發(fā)明了加減法，能夠直接分析100~500個(gè)核苷酸的DNA片段，取得了DNA測(cè)序的重大突破?；驇?kù)也叫基因組文庫(kù)，是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長(zhǎng)期以重組體方式保持在適當(dāng)?shù)乃拗髦??；蛭膸?kù)，也叫cDNA文庫(kù)，經(jīng)克隆后形成文庫(kù)，cDNA文庫(kù)和基因庫(kù)的不同在于，cDNA文庫(kù)在mRNA拼接過程中已經(jīng)除去了內(nèi)含子等成分，便于DNA重組是直接使用。2.5.1.2基因組文庫(kù)的篩選有三種通用的鑒定方法：一是用標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行DNA雜交；二是用抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫雜交：三是對(duì)蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行鑒定。DNA雜交法雙鏈DNA分子可以分子可以通過熱處理或堿變性的方法變性成單鏈DNA分子。退火后有的DNA的兩條鏈分別來自不同的DNA分子，即形成了雜合DNA分子。免疫反應(yīng)法若一個(gè)目的基因DNA序列可以轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，那么只要出現(xiàn)這種蛋白質(zhì)，甚至只需要該蛋白質(zhì)的一部分，就可以用免疫的方法檢測(cè)。酶活性法如果目的基因編碼一種酶，而這種酶又是宿主細(xì)胞所不能編碼的，那么就可以通過檢查酶活性來篩選目的基因的重組子。2.5.2真核生物目的基因的獲得（cDNA方法、DNA的化學(xué)合成法、PCR法）2.5.2.1cDNA方法cDNA文庫(kù)的組建步驟：①分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞②從組織或細(xì)胞中制備總體RNA和mRNA③合成第一條cDNA鏈，合成第一條cDNA鏈需要mRNA作為模板、預(yù)先設(shè)計(jì)的cDNA合成引物、逆轉(zhuǎn)錄酶及4種脫氧核苷三磷酸和相應(yīng)的緩沖液等④第二條cDNA鏈合成⑤cDNA的甲基化和接頭的加入⑥雙鏈cDNA與載體的連接2.7目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目前用做基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌和枯草桿菌。最早應(yīng)用于基因工程，至今仍最廣泛使用的受體細(xì)胞是大腸桿菌。大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物常常在細(xì)胞內(nèi)形成不溶性包涵體，以不正常的蛋白質(zhì)折疊形式存在，產(chǎn)物無生物活性。枯草桿菌主要用于分泌型表達(dá)，缺點(diǎn)是表達(dá)產(chǎn)物容易被枯草桿菌分泌的蛋白酶水解，而且重組質(zhì)粒在枯草桿菌中的穩(wěn)定性較差。將外源重組子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法很多，其中轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于原核的細(xì)菌細(xì)胞和低等的真核細(xì)胞（酵母），而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞。原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程就是一個(gè)攜帶基因的外源DNA分子通過與膜結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞、并在胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的過程。轉(zhuǎn)化過程包括制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化處理。感受態(tài)細(xì)胞是指處于攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑將外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。聚乙二醇（PFG）和多聚賴氨酸等是協(xié)助DNA轉(zhuǎn)移的常用多聚物，可在原生質(zhì)體表面形成顆粒沉淀，使DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞能捕獲粘性附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，并能將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入。脂質(zhì)體是人工構(gòu)建的由磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)。粒子轟擊法普遍應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物，無論植物器官或組織都能應(yīng)用。2.8重組體的篩選重組體篩選的方法很多，歸納起來可分為兩種：在核算水平或蛋白質(zhì)水平上篩選。從核算水平篩選克隆子可以通過核酸雜交的方法。這類方法根據(jù)DNA-DNA、DNA-RNA堿基配對(duì)的原理，以使用基因探針技術(shù)為核心。從蛋白質(zhì)水平上篩選克隆子的方法主要有：檢測(cè)抗生素抗性及營(yíng)養(yǎng)缺陷型、觀測(cè)噬菌斑的形成、檢測(cè)目標(biāo)酶的活性、目標(biāo)蛋白的免疫特性和生物活性等。2.8.1利用抗生素抗性基因2.8.2營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)法若宿主細(xì)胞屬于某一營(yíng)養(yǎng)缺陷型，則在培養(yǎng)這種細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基中必須加入該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，細(xì)胞才能生長(zhǎng)；如果重組后進(jìn)入這種細(xì)胞的外源DNA中除了含有目的基因外再插入一個(gè)能表達(dá)該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基因，就實(shí)現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，使得重組細(xì)胞具有完整的系列代謝能力，培養(yǎng)基中即使不加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也能生長(zhǎng)2.8.3核酸雜交法2.8.4通過免疫反應(yīng)篩選2.8.5通過酶活性篩選2.9目的基因的高效表達(dá)大腸桿菌的許多優(yōu)點(diǎn)確保了它在基因工程中的地位，是一個(gè)最常用的基因高效表達(dá)系統(tǒng)?？莶輻U菌是另一種常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌是常用的真核生物表達(dá)系統(tǒng)2.9.2影響目的基因表達(dá)的基本因素影響外源DNA轉(zhuǎn)錄的主要因素是啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。啟動(dòng)子時(shí)宿主細(xì)胞的RNA聚合酶專一結(jié)合并其實(shí)轉(zhuǎn)錄合成mRNA聚合酶識(shí)別，因此必須將外源基因置于大腸桿菌啟動(dòng)子控制下。Lac、lacUV5、tac等都是常用的強(qiáng)啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄，人工合成的基因后面一定要裝配合適的終止子，以減少能來那個(gè)消耗及保持轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性。強(qiáng)啟動(dòng)子往往需要強(qiáng)終止子予以匹配。翻譯水平影響外源基因表達(dá)的重要因素是翻譯起始區(qū)。翻譯是在核糖體上進(jìn)行的，因此mRNA上必須有核核糖體的結(jié)合部位（稱SD序列）。對(duì)于人工合成的基因來說，密碼子的優(yōu)化亦很重要，應(yīng)該采用宿主菌的偏愛密碼子、保持嘌呤和嘧啶堿基配對(duì)反應(yīng)的能量平衡。翻譯后的加工修飾也將影響表達(dá)水平。包括切除新生肽鍵N端甲酰蛋氨酸、形成二硫鍵、糖基化和肽鍵本身的后加工等。2.9.3目的基因的不溶性高效表達(dá)采用高密度培養(yǎng)及工程菌生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)相分離的兩段培養(yǎng)技術(shù)，包涵體的產(chǎn)量可以達(dá)到很高的水平，對(duì)于不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，利用生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)基簡(jiǎn)單的大腸桿菌為宿主細(xì)胞，采用不溶性融合蛋白表達(dá)策略仍是一種提高目的基因表達(dá)效率的很好選擇。2.9.4目的基因的高效可溶性表達(dá)對(duì)于不少目的蛋白，可通過降低啟動(dòng)子強(qiáng)度和減少培養(yǎng)溫度的手段成功地實(shí)現(xiàn)高水平的可溶性表達(dá)。2.9.5目的建議你的高效分泌型表達(dá)目的基因的分泌型表達(dá)有兩種情形：目的蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中和目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)后再分泌到細(xì)胞外。2.9.6基因工程宿主菌的改造目前基因工程常用宿主是大腸桿菌K12系列和B系列已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一種細(xì)菌（透明菌）內(nèi)含有起輸送氧作用的血紅蛋白基因，通過將血紅蛋白基因整合到大腸桿菌宿主中后，大腸桿菌就能在貧氧條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，從而提高了菌體生長(zhǎng)密度和外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)率。2.9.7利用細(xì)胞培養(yǎng)工程手段提高基因表達(dá)水平2.9.7.1提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性需要從質(zhì)粒構(gòu)建和培養(yǎng)方法改進(jìn)兩條途徑進(jìn)行研究。在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，一般都插入抗生素抗性基因，另外，在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)應(yīng)該加入稱為par和cer的位點(diǎn)，par位點(diǎn)能夠在細(xì)胞分裂工程中使質(zhì)粒分布更均勻，cer位點(diǎn)則能夠防止多聚體質(zhì)粒的形成，從而能從源頭上提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。采用細(xì)胞生長(zhǎng)期和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)期分開的分段培養(yǎng)策略。采用固定化細(xì)胞培養(yǎng)也有利于提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性大腸桿菌的培養(yǎng)可分為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基。高密度培養(yǎng)采用半合成培養(yǎng)基減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成（1）降低比生長(zhǎng)速率（2）降低培養(yǎng)溫度（3）限制性流加葡萄糖（4）基因工程菌培養(yǎng)和乙酸分離耦合過程2.10.1基因工程制藥1982年第一個(gè)基因工程藥物人胰島素就在美國(guó)的EliLilly公司研究成功并投放市場(chǎng)。基因工程藥物常分為四類：激素和多肽類、酶、重組疫苗及單克隆抗體。第一類基因工程藥物主要針對(duì)因缺乏天然內(nèi)源性蛋白所引起的疾病，這類蛋白質(zhì)主要以激素類為代表，如人胰島素、人生長(zhǎng)激素、降鈣素等。第二類基因工程藥物屬于酶類，如tPA、尿激酶及鏈激酶等。第三類屬于疫苗，分為基因工程亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、基因缺少疫苗及蛋白質(zhì)工程疫苗等。第四類產(chǎn)物單克隆抗體2.10.1.21989年我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物干擾素-αlb上市，標(biāo)志著我國(guó)基因工程制藥實(shí)現(xiàn)了零的突破。第三章細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本單元，細(xì)胞工程就是通過大規(guī)模的細(xì)胞或組織培養(yǎng)，獲得所需要的產(chǎn)品。細(xì)胞可以分為動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞三大類。1999年12月，美國(guó)科學(xué)雜志公布了當(dāng)年世界科學(xué)進(jìn)展的評(píng)定結(jié)果，肝細(xì)胞的研究陳果排名在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學(xué)進(jìn)展的首位，那是因?yàn)楦渭?xì)胞的發(fā)現(xiàn)否定了動(dòng)物細(xì)胞不具有全能型的傳統(tǒng)觀念，為人類健康提供了新希望，干細(xì)胞是一類極特殊的來自胚胎或成體的未分化細(xì)胞，同時(shí)具有不斷增長(zhǎng)繁殖的功能以及想多種功能細(xì)胞分化的潛能。由于具備不斷增值與定向分化的雙重功能，肝細(xì)胞具有可用于組織器官生產(chǎn)或新藥刪選的巨大潛力。離體培養(yǎng)環(huán)境可分為鐵臂和復(fù)生長(zhǎng)兩種方式。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)主要有間接培養(yǎng)，流加培養(yǎng)和關(guān)注培養(yǎng)。非致死和致死兩大類。少數(shù)屬于非致死的細(xì)胞，如癌細(xì)胞，表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。一般，將從特定功能組織器官中分離后無法增值或處于未穩(wěn)定傳代培養(yǎng)前的動(dòng)物細(xì)胞稱為原代或初代細(xì)胞，而將能溫度穩(wěn)定傳代培養(yǎng)并能連續(xù)生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞稱為連續(xù)化細(xì)胞。原代細(xì)胞是直接從組織器官中分離得到的，原代細(xì)胞培養(yǎng)一般由組織器官解剖分離，解聚和離體細(xì)胞培養(yǎng)三個(gè)步驟組成，解聚分機(jī)械分離和酶解兩種方法。酶法分離是目前應(yīng)用最廣的動(dòng)物細(xì)胞分離法，最常使用的酶有胰蛋白酶，膠原酶，彈性蛋白酶等。它們可以單獨(dú)或混合使用。原代培養(yǎng)為一系列細(xì)胞培養(yǎng)的第一步，原代細(xì)胞的生理就帶些特性差異非常大，屬于不穩(wěn)定細(xì)胞系。一旦原代細(xì)胞進(jìn)行了傳代培養(yǎng)（亦稱轉(zhuǎn)種），便稱為細(xì)胞系。細(xì)胞系中往往存在有若干表型，相似或相異的細(xì)胞世界系，若其中一世系，經(jīng)過選殖克隆、物理性細(xì)胞分離，或其他選擇技術(shù)，而在培養(yǎng)的細(xì)胞群體中辨識(shí)出其特殊表型性質(zhì)，該細(xì)胞便稱為細(xì)胞株。動(dòng)物細(xì)胞呈圓形，如線粒體是進(jìn)行呼吸的地方，高爾基體是進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化和折疊等后加工的場(chǎng)所，粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜則是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所等。動(dòng)物細(xì)胞的離體培養(yǎng)最初采用天然體液培養(yǎng)基，如小雞胚胎萃取液、血清、淋巴液等?；瘜W(xué)成為明確的培養(yǎng)基配方。旋轉(zhuǎn)瓶和中空纖維反應(yīng)器是比較常見的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)的反應(yīng)器。微載體是一種能懸浮于溶液中，直徑為100-200um的球狀顆粒。聚苯乙烯、葡聚糖和膠原等都是通用的為載體材料，通過加工而成為球狀顆粒。懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器大多在微生物反應(yīng)器基礎(chǔ)上發(fā)展形成，以通氣攪拌罐最常見細(xì)胞懸浮培養(yǎng)操作方式有間歇培養(yǎng)，補(bǔ)料-分批培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)等。植物細(xì)胞培養(yǎng)具有全能型即單一的離體細(xì)胞在一定環(huán)境下分化成不同的細(xì)胞組織乃至整個(gè)植株。植物體受到切割等傷害后會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織的形成實(shí)際上是一種創(chuàng)傷反應(yīng)，是植物脫分化的結(jié)果，產(chǎn)生愈傷組織的植物器官可以是種子，根、莖、葉等。進(jìn)行植物細(xì)胞大估摸培養(yǎng)的基本步驟是，1建立細(xì)胞株，2，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)集中，3.擴(kuò)大培養(yǎng)，現(xiàn)已建立了針對(duì)植物細(xì)胞的而不培養(yǎng)法，及使用生長(zhǎng)培養(yǎng)及使細(xì)胞大量增殖，達(dá)到一定的細(xì)胞密度，然后再改用適合細(xì)胞產(chǎn)物積累得到培養(yǎng)基，促進(jìn)細(xì)胞啟動(dòng)次級(jí)代謝途徑并提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。培養(yǎng)條件的優(yōu)化物理因素，1光對(duì)光的需要與否，2溫度25.左右3PH值，5-6之間?；瘜W(xué)因素1溶氧，2植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基。植物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生理特性1植物細(xì)胞尺寸較大，2植物細(xì)胞對(duì)剪切力非常敏感，3易沉降。4植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，5植物細(xì)胞生長(zhǎng)與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成無顯著關(guān)聯(lián)，6易染菌。從鞘蕊花屬細(xì)胞培養(yǎng)得到的迷迭香酸，以細(xì)胞干重計(jì)含量高達(dá)27%。自1996年美國(guó)大面積推廣種植轉(zhuǎn)基因作物以后，轉(zhuǎn)基因食品以驚人的速度向全球擴(kuò)散。常見的建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法有顯微注射法，逆轉(zhuǎn)錄病毒法與干細(xì)胞法等方法，1顯微注射法2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法3胚胎干細(xì)胞4精子載體法5體細(xì)胞核移植法從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中獲取對(duì)人類有益的基因工程產(chǎn)物，不但具有產(chǎn)量高，容易提純的優(yōu)點(diǎn)，而且表達(dá)的蛋白經(jīng)過了充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。因此被稱為動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器。干細(xì)胞即未分化的細(xì)胞，是一類具有自我更新和分化發(fā)育潛能的原始細(xì)胞。干細(xì)胞分胚胎干細(xì)胞和組織肝細(xì)胞兩類，肝細(xì)胞研究最早是從胚胎干細(xì)胞開始的，經(jīng)過6個(gè)月的增殖，這些胚胎干細(xì)胞，胚胎肝細(xì)胞具有形成所有組織和器官的能力，具有全能型，只能發(fā)育分化成一個(gè)系統(tǒng)中的幾種細(xì)胞，但不能生成其他系統(tǒng)的細(xì)胞，因此這些干細(xì)胞稱為“多能”干細(xì)胞，“多能”干細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育，將生成更加專門化的細(xì)胞，即“專能”干細(xì)胞。它們只能再增殖分化為一種類型的“終端”細(xì)胞。多能及專能干細(xì)胞統(tǒng)稱為組織干細(xì)胞。由于干細(xì)胞的數(shù)目很少，因此需要在體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖，這需要許多生長(zhǎng)因子和間質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子得到培養(yǎng)集中培養(yǎng)，上皮生長(zhǎng)因子，胚胎干細(xì)胞人體發(fā)育起始于卵子的受精，產(chǎn)生一個(gè)能發(fā)育為完整有機(jī)體潛能的單細(xì)胞，及全能型的受精卵造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞分布于骨髓，外周血和臍血中，尤其臍血含有豐富的造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞是造血細(xì)胞的種子，體內(nèi)所有血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等，都是由它分化發(fā)育而來，也是人們認(rèn)識(shí)最早的干細(xì)胞之一。間充質(zhì)干細(xì)胞是分化發(fā)展為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌肉細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞，在成年后主要存在于骨膜下和骨髓腔中，也分布于肌肉，胸腺和皮膚中神經(jīng)及其他干細(xì)胞存在于成體神經(jīng)組織中，具有再生神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突狀細(xì)胞的潛在能力，組織工程的研究幾乎遍及人體所有的器官或組織，20世紀(jì)90年代，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)組織皮膚工程及自體軟骨細(xì)胞移植修復(fù)關(guān)鍵軟骨部分缺損益用于臨床，并開始產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程組織工程按組織器官的構(gòu)筑方式可分為兩個(gè)部分：組織再生工程和組織替代工程組織工程的三種基本要素是細(xì)胞、支架材料與調(diào)節(jié)因子人工支架的作用包括人工細(xì)胞外基質(zhì)、空間確保膜、生長(zhǎng)因子控制釋放、組織生長(zhǎng)的支撐體、免疫隔離膜和生物反應(yīng)器等。酶是一類生物催化劑，其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，同時(shí)又具有催化劑的功能。第四章酶工程酶是一類生物催化劑，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，同時(shí)又具有催化劑的功能。酶工程是蛋白質(zhì)化學(xué)與工程學(xué)相互交叉滲透、相互結(jié)合并發(fā)展而形成的一門新的技術(shù)科學(xué)。酶工程是研究和開發(fā)酶的生產(chǎn)、酶的分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應(yīng)器、酶與固定化酶的應(yīng)用等的工程科學(xué)酶的命名1酶是依據(jù)酶作用的反應(yīng)物2酶所催化的反應(yīng)性質(zhì)來命名3酶的來源或酶的其他特點(diǎn)來取名酶分為6類，1氧化還原酶類，2，轉(zhuǎn)移酶類3，水解酶類4.裂合酶類5異構(gòu)酶類，6，合成酶或鏈接酶類。酶的活力是指酶催化特定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速率。酶的活力還常常是制定酶制劑價(jià)格的最重要的參考指標(biāo)。酶活力的單位是：?jiǎn)挝粫r(shí)間、單位質(zhì)量酶蛋白所催化的底物反應(yīng)或產(chǎn)物生成的物質(zhì)的量酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，借助于各種次級(jí)鍵盤繞城具有特定肽鏈走向的緊密球狀構(gòu)象，寡聚酶是有2個(gè)或2個(gè)以上亞基組成的酶，分子質(zhì)量一般高于30KD，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)酶催化的特點(diǎn)，1，反應(yīng)條件溫和，2，極高的催化效率，3，高度專一性，（底物專一性、反應(yīng)專一性、立體化專一性）4，輔酶和輔因子，許多酶只有在某些非蛋白質(zhì)成分存在時(shí)才表現(xiàn)出催化作用，人們將這些非蛋白質(zhì)成分稱為輔助因子，其中能通過透析出去的稱為輔酶，不能通過透析除去的就叫做輔基因子，5.酶催化活性的調(diào)控機(jī)制酶反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系P103E代表游離酶，ES為酶與底物的復(fù)合物，S為底物，P為產(chǎn)物，k+1、k-1、k+2為相應(yīng)各步反應(yīng)速率常數(shù)。固定酶具有的優(yōu)點(diǎn)：①可以重復(fù)多次使用，而且在大多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性也有明顯改善②催化反應(yīng)后，酶與底物以及產(chǎn)物容易分開，產(chǎn)物中沒有殘留酶，易于分離純化，使產(chǎn)品的質(zhì)量有大的提高③反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)生物催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制④酶的利用效率高，單位酶量催化的底物量增加，而用酶量則大為減少⑤比水溶性酶更合適于多酶催化反應(yīng)。固定化方法按所用載體和操作方法的差異分為：載體結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法等三類，載體結(jié)合法包括物理吸附法、離子結(jié)合法、螯合法和共價(jià)結(jié)合法等，包埋法包括聚合物包埋法、疏水相互作用法、微膠囊包埋法、脂質(zhì)體包埋法等只有L型氨基酸才具有生理活性，外消旋氨基酸必須轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型氨基酸，主要的拆分方法有物理化學(xué)法、化學(xué)法和酶法等三種，其中以酶法最為有效，能夠生產(chǎn)純度較高的L氨基酸。生物傳感器的發(fā)展非常迅速，生物傳感器是用生物活性物質(zhì)做敏感器件，配以適當(dāng)?shù)膿Q能器所構(gòu)成的分析工具，大致可以分為酶?jìng)鞲衅?、微生物敏感器、免疫傳感器和?chǎng)效應(yīng)晶體傳感器等四大類。其中利用酶的催化作用制成的酶?jìng)鞲衅魇菃柺雷钤?、成熟度最高的一類生物傳感器。P116蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以改變蛋白質(zhì)表面電荷和疏水性，從而影響其催化活性和穩(wěn)定性。酶蛋白中個(gè)別氨基酸的置換可以采用點(diǎn)突變的方法很容易就可以完成，點(diǎn)突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要工具。一般地說，經(jīng)過修飾的酶可顯著提高酶活力、增加穩(wěn)定性或降低抗原性、顯著提高酶的使用范圍和應(yīng)用價(jià)值。酶的新用途——靶酶及酶標(biāo)藥物每一種酶都有一些特定的抑制劑，通常將這種酶稱為該抑制劑的靶酶。靶酶的意義傳統(tǒng)上，人們只有根據(jù)某些化合物對(duì)特定疾病有一定治療作用作為設(shè)計(jì)藥物的線索，大量合成出其類似物，從中進(jìn)行篩選，并獲得某種療效最好的藥物。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，每種統(tǒng)計(jì)，每種新藥的上市需要從大約10萬種化合物中篩選得到，可以想象新藥研究和開發(fā)所需的巨大人力、物力和資金投入!隨著人類基因組計(jì)劃完成對(duì)疾病引發(fā)機(jī)理的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生都是由于基因突變引起的酶蛋白表達(dá)水平的變化引起的。這樣一來，只要對(duì)這些酶蛋白的活性水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，就可能治愈疾病。這種對(duì)疾病具有關(guān)鍵作用的酶就是靶酶，篩選得到的能影響和調(diào)節(jié)靶酶活性并能治療疾病的藥物就成為酶標(biāo)藥物。非水系統(tǒng)中的酶催化的特點(diǎn)①絕大多數(shù)有機(jī)化合物在非水系統(tǒng)中的溶解度高于水溶液②根據(jù)熱力學(xué)原理，一些在水中不可能進(jìn)行的反應(yīng)，有可能在非水系統(tǒng)中進(jìn)行③與水相比，酶在非水系統(tǒng)中的穩(wěn)定性比較高④從非水系統(tǒng)中回收反應(yīng)產(chǎn)物比從水相中容易⑤在非水系統(tǒng)中酶很容易回收和反復(fù)使用。根據(jù)酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物稱為人工合成酶或人工模擬酶。P120分子印記技術(shù)自20世紀(jì)80年代初Cech和Altman各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了RNA具有生物催化功能后，人們發(fā)現(xiàn)除蛋白質(zhì)才能有酶的催化功能以外，某些RNA和DNA分子也具有催化功能。目前已知的核酸酶大致上可以分為剪切型核酸酶和剪接型核酸酶?？贵w酶是指通過一系列化學(xué)與生物方法制備的具有催化活性的抗體。第五章微生物工程按細(xì)胞生長(zhǎng)是否需要氧氣，發(fā)酵過程可以分為兩類：好氧和厭氧發(fā)酵。好氧發(fā)酵過程以氧作為電子受體。典型的如動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗生素、有機(jī)酸、氨基酸、酶制劑、單細(xì)胞蛋白等需要向反應(yīng)器中通入無菌空氣，有時(shí)甚至純氧以滿足微生物生長(zhǎng)和代謝對(duì)氧的需求。由于氧在水中的溶解度很低。微生物工程的發(fā)展史大約在9000年前就已經(jīng)開始了原始的啤酒生產(chǎn)。公元前6000年左右，在黑海與里海的外高加索地區(qū)，就已經(jīng)開始種植葡萄和釀制葡萄酒。在公元前2400年左右，在埃及第五王朝的墓葬壁畫上，就有烤制面包和釀酒的大幅浮雕。從19世紀(jì)末-20世紀(jì)30年代，相繼出現(xiàn)了乳酸、乙醇、丙酮/丁醇、甘油、面包酵母等工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品。近30年來，隨著人類在基因水平上改造微生物的技術(shù)——基因工程、代謝工程、組合生物合成等技術(shù)的突飛猛進(jìn)，發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)展，發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容也日益豐富。荷蘭的業(yè)余顯微鏡制造者列文虎克利用自己制造的顯微鏡首先發(fā)現(xiàn)了肉眼看不見的微生物，并描繪了它們的細(xì)節(jié)，為人類打開了認(rèn)識(shí)微觀世界生命活動(dòng)的大門。最早確定發(fā)酵與微生物關(guān)系的是著名的微生物學(xué)家巴斯德。微生物純種培養(yǎng)技術(shù)在自然環(huán)境中，一種微生物常常和其他微生物互相混雜在一起生活。不同微生物的發(fā)酵或引起的疾病是不同的。所以，要研究某種疾病或某種發(fā)酵過程，必須把混雜在一起生活的微生物按種類分開，并分別進(jìn)行培養(yǎng)，即純種培養(yǎng)。我們今天的所有基礎(chǔ)和應(yīng)用微生物學(xué)研究，都離不開培養(yǎng)基、無菌操作、分離和純種培養(yǎng)技術(shù)。德國(guó)醫(yī)生和微生物學(xué)家科赫發(fā)明了固體培養(yǎng)基。采用科赫的劃線分離方法，很容易就能把一個(gè)個(gè)單獨(dú)的菌落挑出來，得到純種微生物。常見的工業(yè)微生物它們的個(gè)體雖然微小，但由于其群體數(shù)量驚人地龐大，因而具有極強(qiáng)的代謝能力。物體的表面積與體積之比稱為比表面積。個(gè)體越小，則比表面積越大，也就是說單位體積物體與環(huán)境的接觸面積越大。比表面積非常有利于微生物通過它們的身體表面積吸收營(yíng)養(yǎng)和排泄廢物，這就使它們的代謝能力特別強(qiáng)。由于微生物個(gè)體小、繁殖快、數(shù)量多，使微生物具有分布廣、種類多、容易變異、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)。微生物代謝能力強(qiáng)、生長(zhǎng)繁殖快的特點(diǎn)使其非常適合于工業(yè)和其他領(lǐng)域。細(xì)菌細(xì)菌是單細(xì)胞原核生物，個(gè)體極小，沒有成型的細(xì)胞核，一般以典型的“一分為二”的裂殖方式繁殖。細(xì)菌根據(jù)外形可以分為球菌、桿菌和螺旋菌三個(gè)大類。球菌按其細(xì)胞排列方式又可以進(jìn)一步分為單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌和鏈球菌等。有些細(xì)胞除了具有一般的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物外，還具有一些特殊的結(jié)構(gòu)，如莢膜、芽孢、鞭毛、絨毛等。芽孢是細(xì)菌的休眠體。有些桿菌和弧菌還能長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)的絲狀物稱為鞭毛，主要成分是蛋白質(zhì)。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，鞭毛的旋轉(zhuǎn)可以推進(jìn)細(xì)菌迅速運(yùn)動(dòng)。球菌通常沒有鞭毛，桿菌中有的有，有的沒有，有的則在生長(zhǎng)過程中的某一階段才有?；【吐菪话愣加斜廾３巳旧wDNA外，很多細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)還存在染色體外的遺傳物質(zhì)，稱為質(zhì)粒。放線菌目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的約6000種抗生素，有4000多種是由放線菌產(chǎn)生的。放線菌有許多交織在一起的纖細(xì)菌體，叫菌絲。在固體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，部分菌絲生長(zhǎng)在培養(yǎng)基內(nèi)負(fù)責(zé)吸收營(yíng)養(yǎng)，因而稱為營(yíng)養(yǎng)菌絲或基內(nèi)菌絲。長(zhǎng)到一定階段便開始繁殖，形成各種各樣形態(tài)各異的孢子。酵母酵母菌是一類最簡(jiǎn)單的真核微生物（真菌），它的細(xì)胞中有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞核。生長(zhǎng)特性絕大多數(shù)酵母都是單細(xì)胞，但是體積比細(xì)菌要大得多，一般呈球形、卵形或檸檬形。第二章《基因工程》復(fù)習(xí)題一、選擇題1.限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是（D）A修復(fù)自身的遺傳缺陷 B促進(jìn)自身的基因重組C強(qiáng)化自身的核酸代謝 D提高自身的防御能力2.生物工程的上游技術(shù)是（D）A基因工程及分離工程 B基因工程及發(fā)酵工程C基因工程及細(xì)胞工程 D基因工程及蛋白質(zhì)工程3.基因工程操作的三大基本元件是:(I供體II受體III載體IV抗體V配體)（A）A.I+II+IIIB.I+III+IVC.II+III+IVD.II+IV+V4.多聚接頭（Polylinker）指的是（A）A.含有多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別及切割順序的人工DNA片段B.含有多種復(fù)制起始區(qū)的人工DNA片段C.含有多種SD順序的人工DNA片段D.含有多種啟動(dòng)基因的人工DNA片段5.下列五個(gè)DNA片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是（D）A.GAAACTGCTTTGAC B.GAAACTGGAAACTGC.GAAACTGGTCAAAG D.GAAACTGCAGTTTC6.若將含有5'末端4堿基突出的外源DNA片段插入到含有3'末端4堿基突出的載體質(zhì)粒上，又必須保證連接區(qū)域的堿基對(duì)數(shù)目既不增加也不減少，則需用的工具酶是（D）IT4-DNA聚合酶IIKlenowIIIT4-DNA連接酶IV堿性磷酸單酯酶A.IIIB.I+IIIC.II+IIID.I+II+III7.下列有關(guān)連接反應(yīng)的敘述，錯(cuò)誤的是（A）A.連接反應(yīng)的最佳溫度為37℃B.連接反應(yīng)緩沖體系的甘油濃度應(yīng)低于10%C.連接反應(yīng)緩沖體系的ATP濃度不能高于1mMD.連接酶通常應(yīng)過量2-5倍8.T4-DNA連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段DNA片段連接在一起，其底物的關(guān)鍵基團(tuán)是（D）A.2'-OH和5'–P B.2'-OH和3'-PC.3'-OH和5'–P D.5'-OH和3'-P9.載體的功能是(I運(yùn)送外源基因高效進(jìn)入受體細(xì)胞II為外源基因提供復(fù)制能力III為外源基因提供整合能力)（D）A.I B.I+III C.II+III D.I+II+III10.克隆菌擴(kuò)增的目的是(I增殖外源基因拷貝II表達(dá)標(biāo)記基因III表達(dá)外源基因)（D）A.I+II B.I+III C.II+III D.I+II+III11.下列各組用于外源基因表達(dá)的受體細(xì)胞及其特點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系中，錯(cuò)誤的是（C）A.大腸桿菌－繁殖迅速 B.枯草桿菌－分泌機(jī)制健全C.鏈霉菌－遺傳穩(wěn)定 D.酵母菌－表達(dá)產(chǎn)物具有真核性12.考斯質(zhì)粒（cosmid）是一種（B）A.天然質(zhì)粒載體B.由λ-DNA的cos區(qū)與一質(zhì)粒重組而成的載體C.具有溶原性質(zhì)的載體D.能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并包裝的載體13.某一重組DNA（6.2kb）的載體部分有兩個(gè)SmaI酶切位點(diǎn)。用SmaI酶切后凝膠電泳上出現(xiàn)四條長(zhǎng)度不同的帶子，其長(zhǎng)度總和與已知數(shù)據(jù)吻合，該重組分子插入片段上的SmaI酶切位點(diǎn)共有（D）A.4個(gè) B.3個(gè) C.2個(gè) D.至少2個(gè)14.外源基因在大腸桿菌中以融合蛋白的形式表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是(I融合基因能穩(wěn)定擴(kuò)增II融合蛋白能抗蛋白酶的降解III表達(dá)產(chǎn)物易于親和層析分離)（D）A.III B.I+II C.I+III D.II+III15.提高重組率的方法包括(I加大外源DNA與載體的分子之比II載體分子除磷III連接酶過量IV延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間)（A）A.I+II B.I+II+III C.I+III+IV D.II+III+IV16.識(shí)別基因序列不同，但酶切后產(chǎn)生的粘性末端相同的一類酶為（B）A.同工酶B.同尾酶C.同裂酶D.同位酶17.pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體應(yīng)有下列何種調(diào)控元件（ABD）A.AmPr和TetrB.ori復(fù)制子C.LacZ標(biāo)記D.多克隆位點(diǎn)18.λ噬菌體外包裝目的基因片段的大小應(yīng)為（D）A.小于λ噬菌體DNA的50%B.小于噬菌體DNA的75%C.大于λ噬菌體DNA的105%D.為λ噬菌體DNA的75%～105%19.DNA連接酶的功能是(AB)A.恢復(fù)3’-OH與5’-P之間的磷酸二酯鍵B.恢復(fù)缺口C.恢復(fù)裂口D.可使平末端與粘性末端連接20.PUC質(zhì)粒作為基因克隆載體應(yīng)有下列何種調(diào)控元件(ABCD)A.AmPrB.ori復(fù)制子C.LacZ標(biāo)記D.多克隆位點(diǎn)21.下列屬于獲取目的基因的方法的是(D)①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫(kù)中提取③從受體細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥22.的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是BA．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接23.有關(guān)基因工程的敘述正確的是DA．限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C．質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料24.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分(B)A.啟動(dòng)子B.終止密碼C.標(biāo)記基因D.目的基因25.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法(B)A．基因槍法B．顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法D．花粉管通道法26.以下說法正確的是（C）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來27.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是（D）A、能復(fù)制B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNA28.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（A）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶29.有關(guān)基因工程的敘述正確的是（D）A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料30.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（C）A、人工合成目的基因B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)31.下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈?zhǔn)牵˙）A.從基因文庫(kù)中獲取目的基因B.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因C.反轉(zhuǎn)錄法D.通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成32.下列有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是ACA、DNA連接酶將粘性末端的堿基對(duì)連接起來B、基因探針是指用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子C、基因治療主要是對(duì)有缺陷的進(jìn)行修復(fù)D、蛋白質(zhì)中氨基酸序列可為合成目的基因提供資料二、是非判斷題1.DNA連接酶是一種能催化二條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，因此該酶既可修復(fù)基因序列中的缺口，也可修復(fù)裂口。（×）2.質(zhì)粒提取后，在瓊脂糖電泳出現(xiàn)一條帶時(shí)說明質(zhì)粒提取純度高，當(dāng)為三條帶時(shí)為純度不高。（×）3、入噬菌體的插入型載體只有一個(gè)單一限制酶切點(diǎn)，替換型載體有2個(gè)成對(duì)的限制性酶切點(diǎn)。（√）4、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的mRNA均具有與rRNA結(jié)合的SD序列，以利于進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。（×）5、cDNA文庫(kù)是包含有細(xì)胞中所有mRNA，因此該文庫(kù)能包含細(xì)胞所有的遺傳信息。（X）1．基因工程可改變生物或其分子的遺傳物質(zhì)（√）2．通過限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶等作用，在體外將不同來源的DNA片斷重新組合成新的DNA分子(重組DNA)。（√）3．基因的“剪刀”是限制性內(nèi)切酶（√）4．基因的“針線”是DNA連接酶（√）5．基因的“運(yùn)輸工具”是載體（√）6．基因的“剪刀”是DNA連接酶（×）7．基因的“針線”是限制性內(nèi)切酶（×）8．將目的基因與載體連接過程是由限制性內(nèi)切酶來完成。（×）9.將目的基因與載體連接過程是由DNA連接酶來完成。（√）10.通過基因工程菌可生產(chǎn)胰島素、人生長(zhǎng)激素、干擾素等蛋白質(zhì)藥物。（√）三、填空題1、在LacI標(biāo)記基因插入外源基因，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在X-gal培養(yǎng)基中顯白色，為陽(yáng)性克隆，未插入基因的克隆顯藍(lán)色，為陰性克隆。2、理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具備以下基本條件，如能自主復(fù)制、一種或多種限制酶的酶切位點(diǎn)、篩選標(biāo)記、分子量小易拷貝。3、點(diǎn)突變的基因系列在堿基替換中，若為一個(gè)嘌呤換成另一個(gè)嘌呤或一個(gè)嘧啶換成另一個(gè)嘧啶者稱轉(zhuǎn)換，若一個(gè)嘌呤換成一個(gè)嘧啶或一個(gè)嘧啶換成一個(gè)嘌呤者稱顛換。4、基因表達(dá)的四大表達(dá)系統(tǒng)分別為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞。5、基因與載體的平末端連接方法有哪些T4連接酶連接法。末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶加同聚物尾巴后，再用DNA連接酶進(jìn)行連接；化學(xué)合成銜接物后連接DNA分子。5、目的基因與載體連接方式有哪些1)粘性末端連接；2）平頭末端連接；3）人工接頭法；4）同源多聚尾連接法6、如何利用抗性標(biāo)記基因篩選陽(yáng)性克??？抗性標(biāo)記篩選；抗性基因插入失活篩選；LacZ基因失活篩選。7、核酸操作的基本技術(shù)有哪些①核酸提取與純化②核酸的檢測(cè)與保存③核酸的凝膠電泳④核酸分子雜交8、基因工程所需的基本條件1、用于核酸操作的工具酶；2、用于基因克隆的載體；3、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞。9、Klenow酶在有dNTP情況下，呈現(xiàn)DNA聚合酶活性，在沒有dNTP情況下呈現(xiàn)外切酶活性。10、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_____聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)__________，是一項(xiàng)在生物__體外__復(fù)制____特定DNA片段___的核酸合成技術(shù)②原理：__DNA復(fù)制________③條件：_____已知基因的核苷酸序列______四種脫氧核苷酸______一對(duì)引物______、_____DNA聚合酶____________________.前提條件：④方式：以_指數(shù)____方式擴(kuò)增，即__2n__（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增11．PCR技術(shù)擴(kuò)增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成____單鏈DNAb、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部__雙鏈______。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的__DNA鏈______。DNA的四種核酸的堿基分別是:胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。25．在基因工程中應(yīng)用的酶類統(tǒng)稱為工具酶。名詞解釋1.同尾酶某些限制性內(nèi)切酶識(shí)別的堿基順序不同，但酶切后產(chǎn)生同樣粘性末端的兩種酶2.柯斯（C0S）質(zhì)粒帶有λ噬菌體的COS位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA順序的大腸桿菌質(zhì)粒。3.SD序列為mRNA能在細(xì)菌核糖體上產(chǎn)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯的特殊序列。4.質(zhì)粒不親和性：在沒有選擇壓力的情況下，兩種不同質(zhì)粒不能夠在同一宿主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。5.cDNA文庫(kù)：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而成的克隆的集合。6.穿梭質(zhì)粒載體：指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)的選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。7.基因(gene)具有特定功能的DNA片段，這些片段有的編碼蛋白質(zhì)，有的編碼rRNA、tRNA，有的則是與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的DNA序列。8.基因重組:由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。9.基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。是在生物體外，通過對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品10.目的基因(objectivegene)：又叫靶基因(targetgene)，是指根據(jù)基因工程的目的,設(shè)計(jì)的所需要的某些DNA分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼(code)11.基因表達(dá)

基因表達(dá)(geneexpression)是指細(xì)胞在生命過程中,把儲(chǔ)存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯,轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子.生物體內(nèi)的各種功能蛋白質(zhì)和酶都是同相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因編碼的.12.雙功能抗體

將識(shí)別效應(yīng)細(xì)胞的抗體和識(shí)別靶細(xì)胞的抗體聯(lián)結(jié)在一起,制成雙功能性抗體,稱為雙特異性抗體.如由識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞(CTL細(xì)胞,NK細(xì)胞,LAK細(xì)胞)表面分子的抗體(CD3抗體或CD16抗體)制成的雙特異性抗體,有利于免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用.五問答題1.真核細(xì)胞基因組中的基因常有內(nèi)含子存在，能否在原核細(xì)胞中表達(dá)？能，為什么？不能，為什么？不能，因?yàn)樵思?xì)胞缺乏對(duì)真核基因中內(nèi)含子的剪接功能和轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。原核生物必須有相應(yīng)的原核RNA聚合酶可識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子,以催化RNA的合成?；虮磉_(dá)是以操縱子為單位，操縱子由數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控功能的部位組成的。因此在構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)必須有1個(gè)強(qiáng)的原核啟動(dòng)子及其兩側(cè)的調(diào)控序列。2.質(zhì)粒單酶切點(diǎn)的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？目的基因片斷與載體由相同的單一限制性核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）消化酶切后,兩者的兩端均具有相同的粘性末端,稱為單酶切點(diǎn)的粘性末端,又稱全同源性粘性末端⑴高背景載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后,載體分子易于自我環(huán)化,既不利于目的基因的重組連接,大大降低陽(yáng)性克隆效率,又可使非重組性載體造成高背景。為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5’-P以抑制DNA的自我環(huán)化。在連接反應(yīng)中,具有5’-P，的目的基因DNA片斷可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA載體通過粘性末端發(fā)生互補(bǔ)連接,盡管產(chǎn)生的重組DNA分子于連接點(diǎn)含有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子,盡管在轉(zhuǎn)化時(shí)其轉(zhuǎn)化效率高于線性低于閉和環(huán),但轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,在菌體內(nèi)其缺口可獲得修復(fù)。⑵雙向插入經(jīng)單一限制核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）切割的目的基因和載體,因二者的粘性末端是相同的,因此在連接反應(yīng)中,目的基因可發(fā)生雙向插入,載體對(duì)目的基因表達(dá)是有方向的,而目的基因可雙向與之相連,這種連接若以克隆目的基因片段為目的沒有影響,若以表達(dá)為目的,我們就要對(duì)插入的片段進(jìn)行方向鑒定,因目的基因由起始密碼子向終止密碼子方向表達(dá)是定向轉(zhuǎn)錄的,一旦啟動(dòng)子與目的基因編碼順序方向相反就不能正確轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA。若構(gòu)建表達(dá)DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組,以便定向克隆。3.將外源性DNA克隆到-LacZ區(qū)段的插入型噬菌體上后，如何篩選重組噬菌體？β-半乳糖苷酶失活的插入型載體，在其基因組中含有一個(gè)大腸桿菌的lacZ區(qū)段，此區(qū)段編碼有β-半乳糖苷酶基因lacZ，在誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）存在下，β-半乳糖苷酶能作用X-gal(5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷)形成藍(lán)色化合物（5-溴-4-氯靛藍(lán)）。這樣由這種載體感染的大腸桿菌lac-指示菌（lac基因缺陷菌），涂布在補(bǔ)加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基平板上，會(huì)形成藍(lán)色的噬斑，但若在lacZ區(qū)段上插入外源DNA片段，就會(huì)阻斷β-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，這種λ重組體感染的lac-指示菌由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成無色的噬菌斑，相反未發(fā)生外源基因插入則出現(xiàn)藍(lán)色噬菌斑，以利篩選。4.基因與載體的平末端連接方法有哪些？簡(jiǎn)要或圖示說明均可。T4DNA連接酶法連接平末端DNA分子的方法有2種，一種是直接用T4連接酶連接，另一種是先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接。T4DNA連接酶同一般的大腸桿菌DNA連接酶不同。T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3’-OH和5’-P末端的雙鏈DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高濃度酶的條件下,它還能夠連接具有完全配對(duì)堿基的平末端DNA分子,但其連接效率比粘性端要低的多。（2）同聚物加尾法運(yùn)用末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账幔ㄍㄟ^脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板鏈的存在,它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸,構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴,長(zhǎng)度可達(dá)100個(gè)核苷酸。5.如何從所克隆到基因重組體中鑒定目的基因的存在和正確性？根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)行篩選只有當(dāng)已知需克隆基因所編碼蛋白質(zhì)的功能,且該蛋白質(zhì)又為細(xì)菌的生命活動(dòng)所必需時(shí),即可用該方法篩選。如：已知蛋白質(zhì)中的亮氨酸（Leu）為L(zhǎng)eu營(yíng)養(yǎng)缺陷菌所必需,當(dāng)外源目的基因可表達(dá)亮氨酸,將該基因的重組子轉(zhuǎn)入Leu缺陷菌中,在不含亮氨酸的基本培養(yǎng)基平板中,只有重組子表達(dá)的亮氨酸才能被Leu缺陷菌所利用而能生長(zhǎng)繁殖,形成菌落。因而能生長(zhǎng)的細(xì)菌集落，均為陽(yáng)性的重組子克隆，而無該重組子的Leu缺陷菌在不含亮氨酸的平板上則不能生長(zhǎng)，不能形成菌落。根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選(1).重組子大小鑒別篩選重組子中因裝有一段較大分子量的外源基因DNA,因此其分子量明顯比原載體大得多,因此可從平板上挑取菌落分別提取重組載體（如質(zhì)粒重組子）和原載體（質(zhì)粒），無需用限制性內(nèi)切酶消化，直接進(jìn)行凝膠電泳，攜帶外源性目的基因的重組子質(zhì)粒因分子量大，電泳遷移率較小，其電泳條帶在后，而原載體質(zhì)粒因分子量較小，電泳遷移率較大，其電泳條帶在前。通過比較可初步判斷重組子中是否插入外源基因片段。本方法適用于插入片段較大的重組子的初步篩選。(2).酶切鑒定對(duì)于篩選出的具有重組子的菌株，應(yīng)經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別提取原載體或重組體載體（重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA），根據(jù)已知重組時(shí)外源基因兩端的酶切位點(diǎn)，分別用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，原載體因無外源性目的基因，切開后變成線性，電泳呈一條帶，若載體上有外源性目的基因插入，切開后電泳出現(xiàn)兩條帶：一條為載體質(zhì)粒線性條帶，一條為釋放出的插入基因片斷的小分子條帶，這樣就可以看出載體中是否有插入的目的基因片斷，以及由DNAmarker條帶對(duì)比分析可得知插入基因片段的大小(3).目的基因序列測(cè)定6.基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是什么？是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明。理論上的三大發(fā)現(xiàn)：①證實(shí)了DNA是遺傳物質(zhì)②揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理③遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定技術(shù)上的三大發(fā)明：①限制核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA切割②DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接③基因工程載體的研究與應(yīng)用7.如何有效地提高外源基因的表達(dá)效率？⑴提高啟動(dòng)子強(qiáng)度⑵縮短啟動(dòng)子同克隆基因間距離⑶高效的翻譯起始序列⑷高效的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)⑸提高質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性⑹用以下方法提高翻譯水平：①調(diào)整SD序列與AUG間的距離②用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基③增加mRNA的穩(wěn)定性的⑺減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷：①誘導(dǎo)表達(dá)②表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制⑻提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表達(dá)融合蛋白②采用某種突變菌株③表達(dá)分泌蛋白質(zhì)8.大腸桿菌作為基因工程受體菌的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？?jī)?yōu)點(diǎn)：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的背景知識(shí)清楚，對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實(shí)踐，大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大腸桿菌易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。缺點(diǎn)：在通常情況下，細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過翻譯后的加工修飾，如正確的折疊和組裝，而細(xì)菌中通常并沒有這樣的修飾機(jī)制，從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無法產(chǎn)生有活性的蛋白；外源真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識(shí)別，并被當(dāng)做“異已分子”降解掉。9.什么是α-互補(bǔ)篩選？質(zhì)粒載體具有β-半乳糖苷酶基因（lacZ），當(dāng)外源DNA插入到它的lacZ，可造成表達(dá)后的β-半乳糖苷酶失活，利用這一點(diǎn)就可以通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加有X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。有些大腸桿菌上帶有l(wèi)acZ基因的部分編碼序列，質(zhì)粒載體中含有別一部分編碼序列，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入載體后，可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失了一部分編碼序列的突變體與帶有這一部分編碼序列的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α互補(bǔ)。10.真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)和原核細(xì)胞的有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？1）相同點(diǎn)：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成。2）不同點(diǎn)：原核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的，真核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。11.基因克隆常用的載體必須具備的基本條件？⒈具有獨(dú)立復(fù)制能力⒉具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))⒊具有遺傳表型或篩選標(biāo)記⒋有足夠的容量以容納外源DNA片段⒌可導(dǎo)入受體細(xì)胞。復(fù)習(xí)題2

基因重組與基因工程一、A型題

1.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的連接外源性DNA和載體DNA的酶是：（A）

A．DNA連接酶

B．DNA聚合酶Ⅰ

C．DNA聚合酶Ⅱ

D．DNA聚合酶Ⅲ

E．反轉(zhuǎn)錄酶

2.用來鑒定DNA的技術(shù)是：（B）

A．Northern印跡

B．Southern印跡

C．Western印跡

D．親和層析

E．離子交換層析

3.下列那項(xiàng)不是重組DNA技術(shù)中常用的工具酶：（D）

A．限制性核酸內(nèi)切酶

B．DNA連接酶

C．DNA聚合酶Ⅰ

D．RNA聚合酶

E．反轉(zhuǎn)錄酶

4.關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的敘述，下列哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的？

（E）

A．限制性核酸內(nèi)切酶分為三類，用于基因工程的為Ⅱ酶

B．限制性核酸內(nèi)切酶切割后可產(chǎn)生粘性末端或平端

C．識(shí)別的核苷酸序列個(gè)數(shù)可以是6個(gè)或8個(gè)D.識(shí)別的序列一般具有回文結(jié)構(gòu)

E．識(shí)別的DNA為單鏈

5.關(guān)于基因工程的敘述，下列哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的？

（B）

A．基因工程也稱基因克隆

B．只有質(zhì)粒DNA可作為載體

C．重組體DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞

D．需獲得目的基因

E．需對(duì)重組DNA進(jìn)行純化、篩選

6.有關(guān)質(zhì)粒的敘述，下列哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的？（E）

A．小型環(huán)狀雙鏈DNA分子

B．可小到2～3Kb大到數(shù)百個(gè)Kb

C．能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立自主地進(jìn)行復(fù)制

D．常含有耐藥基因

E．只有一種限制性核酸內(nèi)切酶切口

7．下列哪項(xiàng)不是重組DNA的連接方式？（C）

A．粘性末端與粘性末端的連接

B．平端與平端的連接

C.粘性末端與平端的連接

D．人工接頭連接

E．同聚物加尾連接

8．DNA克隆不包括下列哪項(xiàng)步驟？（E）

A．選擇一個(gè)適合的載體

B．限制性核酸內(nèi)切酶在特異位點(diǎn)裂解質(zhì)粒和目的基因

C．用連接酶連接載體DNA和目的DNA，形成重組體

D．用載體的相應(yīng)抗生素抗性篩選含重組體的細(xì)菌

E．重組體用融合法導(dǎo)入細(xì)胞

9．基因重組是指DNA分子的：（A）

A．共價(jià)連接

B．氫鍵連接

C．離子鍵連接

D．交換

E．退火

10．在分子生物學(xué)中，重組DNA又稱為：（D）

A.酶工程

B.蛋白質(zhì)工程

C.細(xì)胞工程

D.基因工程

E.DNA工程11．基因工程中，不常用到的酶是（E）

A．限制性核酸內(nèi)切酶

B．DNA聚合酶

C．DNA連接酶

D．逆轉(zhuǎn)錄酶

E．DNA解酶

12．能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類酶稱為：（B）A.DNA內(nèi)切酶

B．限制性內(nèi)切核酸酶

C．非限制性內(nèi)切核酸酶

D．限制性外切核酸酶

E．非限制性外切核酸酶

13．cDNA是指：（A）A．在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA互補(bǔ)的DNA

B．在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與DNA互補(bǔ)的DNA

C．在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA互補(bǔ)的RNA

D．在體內(nèi)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA互補(bǔ)的RNA

E．在體內(nèi)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA互補(bǔ)的DNA

14．質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)是：（A）

A．環(huán)狀雙鏈DNA

B．環(huán)狀單鏈DNA

C．環(huán)狀單鏈RNA

D．線狀雙鏈DNA

E．線狀單鏈DNA

15．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)常?？s寫為：（E）

A．PRC

B．PER

C．PDR

D．BCR

E．PCR

16．用于PCR反應(yīng)的酶是：（E）

A．DNA連接酶

B．堿性磷酸酶

C．逆轉(zhuǎn)錄酶

D．限制性內(nèi)切核酸

E．TaqDNA聚合酶

17．基因工程中使目的基因與載體拼接的酶是：（C）

A．DNA聚合酶

B．RNA聚合酶

C．DNA連接酶

D．RNA連接酶

E．限制性核酸內(nèi)切酶

18．α互補(bǔ)篩選屬于：（C）

A．抗藥性標(biāo)志篩選

B．酶聯(lián)免疫篩選

C．標(biāo)志補(bǔ)救篩選

D．原位雜交篩選

E．免疫化學(xué)篩選

19．確切地講，cDNA文庫(kù)包含：（E）

A．一個(gè)物種的全部基因信息

B．一個(gè)物種的全部RNA信息

C．一個(gè)生物體組織或細(xì)胞的全部基因信息

D．一個(gè)生物體組織或細(xì)胞的全部RNA信息

E．一個(gè)生物體組織或細(xì)胞所表達(dá)mRNA信息

20．下烈描述最能確切表達(dá)質(zhì)粒DNA作為克隆載體特性的是：

（D）

A．小型環(huán)狀雙鏈DNA分子

B．?dāng)y帶有某些耐藥基因

C．在細(xì)胞分裂時(shí)恒定地傳遞給子代細(xì)胞

D．具有自我復(fù)制能力

E．獲得目的基因

21.基因工程中常用限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列，正確的說法是：（E）A.聚胞苷酸B.聚腺苷酸C.6或8個(gè)任意核苷酸D.4或6個(gè)任意核苷酸E具有回文結(jié)構(gòu)22．基因工程的基本過程不包含：（E）A.DNA重組體的形成及轉(zhuǎn)化B.限制酶的切割C.載體及目的基因的分離D.重組體的篩選與鑒定E.重組體的序列分析23.有關(guān)理想質(zhì)粒載體的特征，正確的是：（B）A.其復(fù)制受宿主控制B.含有多種限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)C．含有同一限制酶的多個(gè)切點(diǎn)D．為線性單鏈DNAE．不含耐藥基因24.下列那個(gè)物質(zhì)一般不用作基因工程的載體：（C）A．噬菌體B．質(zhì)粒C．大腸桿菌基因組D．反轉(zhuǎn)錄病毒DNAE．人工酵母染色體25.基因工程的操作程序可簡(jiǎn)單的概括為：（E）A．將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并篩選B．限制酶的應(yīng)用C．將載體和目的基因接合成重組體D．目的基因和載體的分離提純與鑒定E．分、切、接、轉(zhuǎn)、篩26.基因表達(dá)的多級(jí)調(diào)控不包括：（A）A．DNA復(fù)制B．轉(zhuǎn)錄起始C．轉(zhuǎn)錄后加工D.翻譯起始E.翻譯后加工27.下列基因工程中的目的基因的來源，最不常用的是：（C）A.人工合成DNAB．從mRNA合成cDNAC.從真核生物染色體DNA中直接分離D．從基因文庫(kù)中獲取E．從細(xì)菌基因組DNA中直接分離28.Ⅱ型限制性內(nèi)切酶是：（B）A．有內(nèi)切酶和甲基化酶活性B.僅有內(nèi)切酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供C．有外切酶和甲基化酶活性D．限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列E．僅有外切酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供29.基因工程操作應(yīng)用的許多載體質(zhì)粒都有抗生素的抗性基因，這是為了便于：（D）

A．外源基因插入質(zhì)粒

B.宿主菌的生物繁殖

C．質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

D．帶有目的基因的宿主菌的篩選

E．目的基因的表達(dá)30.有關(guān)目的基因與載體連接的敘述錯(cuò)誤的是：（E）A.可以同一限制酶切割產(chǎn)生粘性末端連接B.平末端切口可采用“尾接法”C．平末端切口可直接連接D．均需DNA連接酶參與E．不同限制型內(nèi)切酶切割不能連接1．基因工程的單元操作順序是（

A

）Ａ．酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選，驗(yàn)證

Ｂ．酶切，轉(zhuǎn)化，連接，篩選，驗(yàn)證Ｃ．連接，轉(zhuǎn)化，篩選，驗(yàn)證，酶切

Ｄ．驗(yàn)證，酶切，連接，篩選，轉(zhuǎn)化Ｅ．酶切，連接，篩選，轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證2．下列五個(gè)DNA片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是（

D、E

）

Ａ．GAAACTGCTTTGAC

Ｂ．GAAACTGGAAACTG

Ｃ．GAAACTGGTCAAAG

Ｄ．GAAACTGCAGTTTC

Ｅ．GAAACTGCAGAAAG3．T4-DNA連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段DNA片段連接在一起，其底物的關(guān)鍵基團(tuán)是（

D

）

Ａ．2'-OH和5'-P

Ｂ．2'-OH和3'-P

Ｃ．3'-OH和2'-P

Ｄ．3'-OH和5'-P

Ｅ．5'-OH和3'-P4．噬菌體l-DNA體外包裝的上下限是天然l-DNA長(zhǎng)度的（D

）

Ａ．25-50%

Ｂ．50-100%

Ｃ．75-100%

Ｄ．75-105%

Ｅ．100-125%8．分子雜交的化學(xué)原理是形成（E

）

Ａ．共價(jià)鍵

Ｂ．離子鍵

Ｃ．疏水鍵

Ｄ．配位鍵

Ｅ．氫鍵9．促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素（EPO）基因能在大腸桿菌中表達(dá)，但卻不能用大腸桿菌的基因工程菌生產(chǎn)人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素，這是因?yàn)椋?/p>

E

）

Ａ．人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)大腸桿菌有毒性作用

Ｂ．人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素基因在大腸桿菌中極不穩(wěn)定

Ｃ．大腸桿菌內(nèi)毒素與人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素特異性結(jié)合并使其滅活

Ｄ．人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)大腸桿菌蛋白水解酶極為敏感

Ｅ．大腸桿菌不能使人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素糖基化10．鳥槍法克隆目的基因的戰(zhàn)略適用于（

A

）

Ａ．原核細(xì)菌

Ｂ．酵母菌

Ｃ．絲狀真菌

Ｄ．植物

Ｅ．人類11．cDNA第一鏈合成所需的引物是（D）

Ａ．PolyA