食品中空腸彎曲菌檢測

關(guān)于食品中空腸彎曲菌檢測

一、空腸彎曲菌的分類和特性：屬于彎曲菌屬。主要包括空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni）、結(jié)腸(或大腸）彎曲菌（Campylobactercoli）、海鷗彎曲菌（Campylobacterlari）、烏普色拉彎曲菌（Campylobacterupsalensis）、胎兒彎曲菌（Campylobacterfetus）等11種。其中空腸彎曲菌（C.jejuni）對食品安全的威脅最為嚴(yán)重。第2頁,共33頁，2024年2月25日，星期天空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni）是從20世紀(jì)80年代起受到國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病菌。

致病性：人類：急性細(xì)菌性腸炎、格林-巴利綜合征（GBS）、食物中毒。動物：雛雞腹瀉與肝炎；火雞的肝炎與藍(lán)冠病。犢牛的腹瀉；綿羊的腹瀉或流產(chǎn)。第3頁,共33頁，2024年2月25日，星期天空腸彎曲菌的生物學(xué)特性

革蘭氏染色陰性。呈弧形，S形或螺旋形；菌體兩端尖，有極鞭毛，能做快速直線或螺旋體狀運(yùn)動；

1.5～5μm×0.2～0.5μm，無莢膜。微需氧環(huán)境：5%O2、10%CO2和85%N2。最適生長溫度：42-43℃，37℃可生長，30℃以下不生長。第4頁,共33頁，2024年2月25日，星期天空腸彎曲桿菌的流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)

宿主：家禽、野生鳥類為最主要的傳染源。

(Rosef等在1981年調(diào)查了129個野生鳥類，結(jié)果表明24.8%攜帶空腸彎曲菌)

鳥類遷移會造成病原菌對湖水與河水的污染。

第5頁,共33頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌分布范圍*該菌分布廣泛，已從多種動物中分離出；也發(fā)現(xiàn)于食物與飲水中，尤其是畜禽肉及臟器與鮮奶。*食用動物中雞的帶菌率為首位，其次為豬。主要分布在活雞的消化系統(tǒng)中如腺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、泄殖腔等。*該菌在人或動物的糞便中存活約4周；在被污染的水源中可存活約5周。第6頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

感染途徑：

*

傳播途徑主要是由于攝取了該菌污染的食物與飲水后，細(xì)菌在人腸道內(nèi)大量生長繁殖，引起急性腸炎。

*

被污染的禽肉與未經(jīng)過巴氏消毒的牛奶是導(dǎo)致發(fā)病的主要原因.第7頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

患者臨床表現(xiàn)：

患者表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、嘔吐或肌肉痛。潛伏期平均3-5天，病程約7-10天，糞便的特征是有時帶血，鏡檢中有多形核白血球，重癥病例也有痢疾樣血、粘液糞便。第8頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心（USA-CDC）多年的美國食源性病原微生物引起發(fā)病人數(shù)的統(tǒng)計資料，空腸彎曲菌導(dǎo)致的病例數(shù)排名第二。禽肉、生牛奶中的空腸彎曲菌被美國列為重點(diǎn)監(jiān)測食源性致病菌之一。32ndCCFH（1999年）提出5組優(yōu)先評估的“病原-食品”組合,其中包括“禽肉-空腸彎曲菌”?？漳c彎曲菌在許多發(fā)達(dá)國家也是被報告最普遍的胃腸炎致病菌之一，如：美國、英國、丹麥、芬蘭、愛爾蘭、荷蘭、挪威、瑞典、瑞士等。第9頁,共33頁，2024年2月25日，星期天二、空腸彎曲菌的檢驗技術(shù)

第10頁,共33頁，2024年2月25日，星期天空腸彎曲菌空腸彎曲菌：

在微需氧條件下42℃生長而25℃不能生長，在選擇性固體培養(yǎng)基上形成特征性菌落，按照本標(biāo)準(zhǔn)檢驗時具有相符合的運(yùn)動特性、生長特性與生化特性的革蘭氏陰性菌。第11頁,共33頁，2024年2月25日，星期天設(shè)備和材料微需氧培養(yǎng)裝置:能夠提供微需氧條件（5%O2、10%CO2和85%N2)

如使用產(chǎn)氣劑的厭氧罐/袋或其它可代用的裝置等。第12頁,共33頁，2024年2月25日，星期天三氣培養(yǎng)箱（如Binder等

)第13頁,共33頁，2024年2月25日，星期天彎曲菌檢驗程序第14頁,共33頁，2024年2月25日，星期天增菌液接種方法一：稀釋處理將24h和48h的增菌液原液分別劃線接種mCCDA平板.（備注：也可選用CFA顯色平板或SimPlate分離鑒定及定量培養(yǎng)基）優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便缺點(diǎn)：可能會有雜菌干擾第15頁,共33頁，2024年2月25日，星期天mCCDA平板上所挑取的可疑菌落通常帶有金屬光澤、扁平、濕潤、沿劃線生長。第16頁,共33頁，2024年2月25日，星期天CFA顯色平板上所挑取的可疑菌落為紅色、突起、濕潤，菌落較小直徑約2～3mm，邊緣有一圈紅色的透明環(huán)，中間有一個圓形的不透明、顏色較深的紅色小點(diǎn)的菌落。第17頁,共33頁，2024年2月25日，星期天將所挑取的3～5個可疑菌接種到不含抗生素的哥倫比亞血瓊脂平板，微需氧條件下42±0.5℃培養(yǎng)24h-48h后，進(jìn)行后續(xù)的空腸彎曲菌鑒定。第18頁,共33頁，2024年2月25日，星期天空腸彎曲菌的鑒定快速鑒定

1.形態(tài)與動力性檢測*對挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，空腸彎曲菌為革蘭氏陰性，彎曲如小逗點(diǎn)狀，兩菌體的末端相接時，呈S形、海鷗展翅狀或螺旋狀。*對挑取可疑菌落制作濕片，鏡檢可見本菌呈螺旋樣運(yùn)動。

第19頁,共33頁，2024年2月25日，星期天快速鑒定2.氧化酶試驗

使用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒，挑取單個菌落的一部分，然后接種到用氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在10秒內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭或深藍(lán)色為陽性，彎曲菌則為陽性。

第20頁,共33頁，2024年2月25日，星期天快速鑒定3.過氧化氫酶檢測

挑取一環(huán)菌落培養(yǎng)物，加到在干凈顯微鏡玻片上的一滴3％過氧化氫溶液中，如果在30秒內(nèi)出現(xiàn)氣泡則判定結(jié)果為陽性。第21頁,共33頁，2024年2月25日，星期天快速鑒定4.馬尿酸鹽水解試驗挑取欲檢測的菌落培養(yǎng)物，加到盛有0.4mL1％的馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液，注意不要帶入培養(yǎng)基瓊脂?；旌暇鶆蚝笤?7℃水浴中溫育2h或36℃培養(yǎng)箱中溫育4h。輕輕地在馬尿酸鹽溶液的頂部加入0.2mL茚三酮溶液，不要振蕩，在37℃水浴或36℃培養(yǎng)箱中溫育10min后判讀結(jié)果。若出現(xiàn)黑紫色則為陽性；若出現(xiàn)淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。第22頁,共33頁，2024年2月25日，星期天快速鑒定5.吲哚乙酸脂水解試驗挑取欲檢測的菌落培養(yǎng)物，加到羥基吲哚醋酸鹽紙片上面，再滴加一滴滅菌蒸餾水。如果吲哚乙酸脂水解，則在5～10min內(nèi)出現(xiàn)深藍(lán)色；若沒有顏色變化則表示水解反應(yīng)沒有發(fā)生。第23頁,共33頁，2024年2月25日，星期天后續(xù)鑒定

1.微需氧條件下25℃生長試驗

2.有氧條件下42±0.5℃生長試驗

3.先鋒霉素（頭孢霉素）的敏感性檢測（可選）

ISO：奈啶酮酸的敏感性檢測（越來越多的C.jejuni與C.coli的非特異性菌株出現(xiàn)）第24頁,共33頁，2024年2月25日，星期天后續(xù)鑒定微需氧條件下25℃生長試驗挑取欲檢測的菌落培養(yǎng)物，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，25℃微需氧條件下培養(yǎng)48±4h，若為空腸彎曲菌則不出現(xiàn)生長。第25頁,共33頁，2024年2月25日，星期天后續(xù)鑒定有氧條件下42±0.5℃生長試驗

挑取欲檢測的菌落培養(yǎng)物，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，42±0.5℃有氧條件下培養(yǎng)48±4h，若為空腸彎曲菌則不出現(xiàn)生長。第26頁,共33頁，2024年2月25日，星期天后續(xù)鑒定先鋒霉素（頭孢霉素）的敏感性檢測（可選）挑取菌落培養(yǎng)物，在布氏肉湯中制備成濃度為0.5McFarland的菌懸液，再用布氏肉湯制備1：10的稀釋液，在5％MuellerHinton血瓊脂平板上進(jìn)行涂布，靜置5min后去除多余液體，將平板在36℃培養(yǎng)箱中放置10min。將先鋒霉素（頭孢霉素）藥敏紙片放在瓊脂表面。培養(yǎng)皿蓋子在上面，36℃微需氧條件下將平板培養(yǎng)22±2h。如果細(xì)菌緊貼著紙片生長則為有抗性；如果紙片周圍出現(xiàn)不同程度的細(xì)菌抑制生長則為敏感第27頁,共33頁，2024年2月25日，星期天主要彎曲菌的生化特性與鑒定表：

空腸彎曲菌結(jié)腸彎曲菌海鷗彎曲菌烏普薩拉彎曲菌.形態(tài)、動力性：革蘭氏陰性，彎曲如小逗點(diǎn)狀，兩菌體的末端相接時呈S形或螺旋狀或海鷗展翅狀，并呈現(xiàn)螺旋樣運(yùn)動氧化酶試驗：陽性過氧化氫酶試驗：＋＋＋—

或微弱馬尿酸鹽水解試驗：＋—

—

—

吲哚乙酸脂水解試驗：＋＋—

＋先鋒霉素敏感性：RRRS微需氧條件25℃生長試驗：不生長有氧條件42生長試驗：不生長（注：＋陽性；—

陰性；S敏感；R有抗性）第28頁,共33頁，2024年2月25日，星期天已試用過的彎曲菌生化鑒定與篩選檢測的商品化試劑

C.1彎曲菌的生化鑒定系統(tǒng)

C.1.1API為手工生化鑒定系統(tǒng)，用于彎曲菌的菌種鑒定，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，所需時間1天。（需要一定的技術(shù)與經(jīng)驗積累）

C.1.2VITEK2為自動生化鑒定系統(tǒng)，可以鑒定出空腸彎曲菌空腸亞種、結(jié)腸彎曲菌、胎兒彎曲菌胎兒亞種，且結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便，所需時間6小時左右。第29頁,共33頁，2024年2月25日，星期天微生物API鑒定系統(tǒng)

第30頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

C.2彎曲菌的篩選檢測方法C.2.1

miniVidas用于彎曲菌的初篩，原理為酶聯(lián)熒光免疫分析(ELFA)方法。對于結(jié)果陰性的可以直接判定為陰性，對于結(jié)果陽性的需進(jìn)一步確認(rèn)，可比傳統(tǒng)方法快2天。（具體參照廠家說明）C.2.2BAX系統(tǒng)原理為利用