食品中菌落總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)

關(guān)于食品中菌落總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)

目前，食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)一般分為菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。細(xì)菌計(jì)數(shù)食品中菌落總數(shù)通常指1g，1ml或1cm2面積食品上的細(xì)菌數(shù)目而言的，而不考慮其種類。由于檢測(cè)計(jì)數(shù)方法的不同,一般有兩種表示方法（菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)）。

食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)概論第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天菌落總數(shù):菌落（Colony）菌落(colony)：生長在固體培養(yǎng)基上，來源于一個(gè)細(xì)胞，肉眼可見的細(xì)胞群體。第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

一種是在嚴(yán)格規(guī)定條件下（樣品處理，培養(yǎng)基及其pH培養(yǎng)溫度與時(shí)間、計(jì)數(shù)方法等），使適應(yīng)這些條件的每一個(gè)活菌細(xì)胞必須而且只能生成一個(gè)肉眼可見的菌落，經(jīng)過計(jì)數(shù)所獲得的結(jié)果稱為該食品的菌落總數(shù)。

第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天另一種是將食品經(jīng)過適當(dāng)處理（溶解和稀釋）后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，這樣計(jì)數(shù)的結(jié)果，既包括活菌，也包括尚未被分解的死菌體，因此稱為細(xì)菌總數(shù)。

目前我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的細(xì)菌總數(shù)實(shí)際上是指菌落總數(shù)。即指的是在平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)。

第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天那么檢測(cè)食品中的菌落總數(shù)有何衛(wèi)生學(xué)意義呢？

一方面，它可以作為食品被污染程度的標(biāo)志。檢測(cè)食品中的菌落總數(shù)，可以了解食品在生產(chǎn)中，從原料加工到成品包裝受外界污染的情況．從而反映食品的衛(wèi)生質(zhì)量。一般來說、菌落總數(shù)越多，說明食品的衛(wèi)生質(zhì)量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落總數(shù)僅少量存在時(shí)，病原菌污染的可能性就會(huì)降低或者幾乎不存在。

許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食品中細(xì)菌總數(shù)能夠反映出食品的新鮮程度、是否變質(zhì)以及生產(chǎn)過程的一般衛(wèi)生狀況等。一般來講，食品中細(xì)菌總數(shù)越多，則表明該食品污染程度越重，腐敗變質(zhì)的可能性越大。第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

另一方面，它可以用來預(yù)測(cè)食品可能存放的期限程度。如實(shí)驗(yàn)表明，菌數(shù)為105cfu/cm2的魚，在0℃下可保持6d，而菌數(shù)為103cfu/cm2時(shí)，保存期可達(dá)12d。但上述規(guī)則也有例外，有些食品成品的菌落總數(shù)并不高，但由于已有細(xì)菌繁殖并已產(chǎn)生了毒素，且毒素性狀穩(wěn)定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通過微生物的作用而制成的，且是活菌制品。

第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

自然界細(xì)菌的類很多，各種細(xì)菌的生理特性和所要求的生活條件不盡相同，（如嗜溫菌30-37℃，4.8±3hr；嗜冷菌

20-25℃5-7d或5-10℃10-14d；嗜熱菌

45-55℃2-3天）如果要檢驗(yàn)樣品中所有種類，必須用不同培養(yǎng)基及不同培養(yǎng)條件去滿足其要求，才能把各種細(xì)菌都檢驗(yàn)出來，這樣工作量將會(huì)很大。我們也知道，自然界盡管細(xì)菌種類很多，但異養(yǎng)、中溫、好氣性細(xì)菌占絕大多數(shù)。因此，嚴(yán)格講，用這種方法所得到的結(jié)果，主要是一些能在平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上生長的，好氧性嗜溫細(xì)菌的菌落總數(shù)。但是把它們作為細(xì)菌總數(shù)已得到公認(rèn)。這不僅在食品的衛(wèi)生檢驗(yàn)中，而且在一切微生物區(qū)系分析中，都把它們作為了細(xì)菌總數(shù)的指標(biāo)。

注意：是并不是所有食品都規(guī)定細(xì)菌指標(biāo)，如酸乳、酸泡菜等。第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天因此，菌落總數(shù)的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)食品的新鮮度和衛(wèi)生質(zhì)量有著一定的衛(wèi)生指標(biāo)的作用，但本能單憑此一項(xiàng)指標(biāo)來判定食品的衛(wèi)生質(zhì)量，還必須配合大腸菌群和致病菌等檢驗(yàn)，才能作出比較全面、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天一、菌落總數(shù)測(cè)定法菌落總數(shù)（aerobicplatecount）

食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)，所得1mL(或1g)檢樣中形成菌落的總數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天GB/T4789.2-2010本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.2-2008相比主要修改如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；(食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定/食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定)——修改了菌落總數(shù)計(jì)算公式中的解釋；——修改了培養(yǎng)基和試劑；——?jiǎng)h除了第二法菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法。

(——培養(yǎng)基由營養(yǎng)瓊脂改為平板計(jì)數(shù)瓊脂；

——菌落總數(shù)計(jì)算公式進(jìn)行了修改；

——增加了第二法“菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法”；)-2008

第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3.設(shè)備和材料3.1

恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃

30℃±1℃。

3.2冰箱：2℃～5℃。

3.3恒溫水浴箱：46℃±1℃。

3.4天平：感量0.1g。

3.5均質(zhì)器

3.6振蕩器

3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸頭。

3.8無菌錐形瓶：容量為250mL、500mL。

3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑為90mm。

3.10

pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。

3.11放大鏡或/和菌落計(jì)數(shù)器或PetrifilmTM自動(dòng)判讀儀。

3.12無菌刀、剪子、鑷子等。第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4培養(yǎng)基和試劑4.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PlatecountagarPCA)，見附錄A中A.1。pH＝7.0±0.2

4.2磷酸鹽緩沖稀釋液，見附錄A中A.2。pH＝7.24.3無菌生理鹽水,見附錄A中A.3：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。(4.41mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL水中。

4.51mol/L鹽酸（HCl）：移取濃鹽酸90mL，用蒸餾水稀釋至1000mL4.6PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片（aerobiccountplate）和壓板。)4.775%乙醇。

區(qū)別：pH值（08：pH＝7.0±0.2；03：pH＝7.2～7.4）第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序

-----細(xì)菌總數(shù)

5、

第一法平板菌落計(jì)數(shù)法第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6、操作步驟6.1.1固體和半固體食品：以無菌操作稱取25g樣品，放入于裝有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或0.85％生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，制成1:10樣品勻液；或放入于225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min制成1:10的樣品勻液。

6.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液（表面取樣的樣品按一定的比例制成1:1樣品勻液和/或1:10樣品勻液。）。

6.1樣品的稀釋第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1.0mL，沿管壁緩慢注于裝有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

6.1.4另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，如此每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。

6.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，吸取1.0mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)分別取1mL稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。

6.1.6樣品勻液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)注入平皿約15mL～20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1.0mL空白稀釋液的無菌平皿內(nèi)作對(duì)照。第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.2培養(yǎng)6.2.1瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品采用30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h(08新增)。6.2.2瓊脂凝固后，如果懷疑樣品中含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時(shí)，可在表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），并在報(bào)告上記錄該操作，待覆蓋層凝固，翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1條件進(jìn)行操作

第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.3菌落計(jì)數(shù)

可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄相應(yīng)的菌落數(shù)量和稀釋倍數(shù)。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colonyformingunits,CFU）表示。

6.3.1平板菌落數(shù)的選擇

選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU個(gè)之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU個(gè)菌落的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)。第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.3.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2，代表全平板菌落數(shù)。6.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，即將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。如有鏈狀菌落生長時(shí)(菌落之間無明顯界線)，若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、平皿分4部分點(diǎn)數(shù)（見圖）

2、求同一稀釋度的平均菌落數(shù)如：A1數(shù)+A2數(shù)

26.4、菌落計(jì)數(shù)方法第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1.若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。

（見表例1）。

2.若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)（30～300個(gè)菌落）時(shí)，按如下公式計(jì)算：

N=∑C/(n1

+0.1n2)d式中：

N—樣品中菌落數(shù)；∑C—平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

n1—

第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；

n2—

適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；

d—

稀釋因子（第一稀釋度）；7.結(jié)果的表述7.1菌落總數(shù)的計(jì)算方法：第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天示例：

稀釋度

1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）

菌落數(shù)

232，24433，35N=∑C/(n1

+0.1n2)d＝(232+244+33+35)/(2+0.1×2)×10-2=544/0.022=24727上述數(shù)據(jù)經(jīng)“四舍五入”后，表示為25000或2.5×104。

3.若所有平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表例4）。第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表例5）

5.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表例6）。

6.若所有稀釋度的菌落數(shù)均不可計(jì)數(shù)，則以最高稀釋倍數(shù)無法計(jì)數(shù)報(bào)告之（見表例7）。第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告:

菌落數(shù)報(bào)告結(jié)果1、30~300之間平均菌落數(shù)

X

稀釋倍數(shù)

2、在30~300之間(若有兩個(gè)稀釋度)

按新公式計(jì)算（舊標(biāo)準(zhǔn)：求比值>2取較小稀釋倍數(shù)；<2取平均數(shù)）3、>300最高稀釋度平均菌落數(shù)X

最高稀釋倍數(shù)4、<30最低稀釋菌度平均落數(shù)X

最低稀釋倍數(shù)5、>300或<30取最接近的X

稀釋倍數(shù)

6、無法計(jì)數(shù)報(bào)告無法計(jì)數(shù)

第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天稀釋度選擇及細(xì)菌總數(shù)報(bào)告方法（表7）稀釋液及菌落數(shù)

10-110-210-3

11,36516420

16，400

16，000或1.6×104

22,7602954637，7503.1000或3.1×1032,8902716027，1003不可計(jì)4，650513513，000510，000或5.1×105427115270

270或2.7×1025無菌落

無菌落無菌落<1×10

<106不可計(jì)3051230，50031，000或3.1×10-3

稀釋

倍數(shù)

平均

菌落數(shù)例次細(xì)菌總數(shù)(個(gè)/g或個(gè)/ml)

報(bào)告方式(個(gè)/g或個(gè)/ml)第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天7.2.1菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“四舍五入”方式修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。

7.2.2大于或等于100時(shí)，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”方式修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時(shí)也按“四舍五入”方式修約，采用兩位有效數(shù)字。

7.2.3若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。

7.2.4若空白對(duì)照上有菌落生長，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。

7.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，按體積取樣的以CFU/mL為單位報(bào)告(表面取樣以CFU/cm2報(bào)告)。

7.2、菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告：第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二、食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)

在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。GB4789.3-2003GB4789.3-2010第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天其中包括大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和一些中間類型的細(xì)菌，這群細(xì)菌能在含有膽鹽的培養(yǎng)基上生長。實(shí)際上包括埃希氏菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等，其中以埃希氏菌屬為主，稱為典型大腸桿菌，其它三屬稱為非典型大腸桿菌。第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

由于大腸菌群都是直接或間接來自人或溫血?jiǎng)游锏募S便，來自糞便以外的極為罕見，所以大腸菌群作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)有以下兩方面的意義。一方面，它可以作為糞便污染食品的指標(biāo)菌。如果食品中檢出大腸菌群，表明該食品曾受到人或溫血?jiǎng)游锛S便污染。如有典型大腸桿菌存在，說明該食品受到糞便近期污染。如有非典型大腸桿菌存在，說明該食品受到糞便陳舊污染。

另一方面，它可以作為腸道致病菌污染食品的指標(biāo)菌。威脅食品安全性的主要是腸道致病菌。第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

我國和許多國家的大腸菌群檢驗(yàn)結(jié)果均采用大腸菌群MPN來表示，2003標(biāo)準(zhǔn)采用每100ml（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表示，2008\2010標(biāo)準(zhǔn)采用每1mL(g)樣品中大腸菌群最近似數(shù)表示。

MPN值是按一定方案檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)數(shù)值，這種檢驗(yàn)方案，在我國GB/T4789.3-2010中將過去的“采用樣品三個(gè)稀釋度各三管的乳糖發(fā)酵三步法”修改“兩步法”。第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天GB/T5009.3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；——“第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15CFU～150CFU”；——?jiǎng)h除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法”。第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

二、

細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序----大腸菌群GB4789.3-2010第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天GB4789.3-2003第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3.設(shè)備和材料3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒溫水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無菌錐形瓶：容量500mL。3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計(jì)數(shù)器。第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4.培養(yǎng)基和試劑區(qū)別：培養(yǎng)基pH值（4.1:6.8±0.2;4.2:7.2±0.1;4.3:7.4±0.1；4.4:7.2）

滅菌溫度（121℃/15min）4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。4.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。4.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。4.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。4.5無菌生理鹽水：見附錄A中A.5。4.6無菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。4.7無菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

6.1樣品的稀釋6.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。6.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。6操作步驟第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。6.1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。6.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.2初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯/乳糖膽鹽發(fā)酵管，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。2003版增加-分離培養(yǎng):伊紅美藍(lán)瓊脂平板(36℃±1℃,24h±2h)第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天操作示意圖1mL1mL1mL10-110-210-310-410mL10mL10mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL空白S1S21mL1mL1mL滅菌生理鹽水雙料

復(fù)發(fā)酵(BGLB/乳糖發(fā)酵管)陽性管進(jìn)行伊紅美藍(lán)瓊脂第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管/乳糖發(fā)酵管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告

按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8.1樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。8.2平板計(jì)數(shù)8.2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。8.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU

之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8.4證實(shí)試驗(yàn)

從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8.6培養(yǎng)基和試劑第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯

A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天A.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）