SN 1460-2004輸入性蚊類攜帶西尼羅病毒與圣路易腦炎病毒的檢測(cè)方法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)輸入性蚊類攜帶西尼羅病毒與圣路易腦炎病毒的檢測(cè)方法Detectingmethodsforwestnilev2004-11-17發(fā)布2005-04-01實(shí)施I本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。1輸入性蚊類攜帶西尼羅病毒與圣路易腦炎病毒的檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)對(duì)輸入性蚊類體內(nèi)攜帶西尼羅病毒與圣路易腦炎病毒的檢測(cè)和報(bào)告，下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)稱型單股正鏈RNA病毒，約1000bp~11000bp.5生物安全要求下列操作必須在生物安全3級(jí)(BSI,3)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行： 用蚊胸腔接種的方法分離病毒 收集或濃縮病毒或其培養(yǎng)產(chǎn)物 可能產(chǎn)生含病毒氣溶膠的樣品處理： 離心管和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的封閉和開(kāi)啟，26.1.2試劑應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。用于PCR(包括核酸抽提)時(shí)所用的水必須是無(wú)RNA酶6.1.2.4RNA抑制劑(RNasin)a)引物對(duì)1如下：——上游引物WNENV—forward:5'-TCAGCGATCTCTCCACCAAAG-3’b)引物對(duì)2如下：——上游引物WN233:5'-TTGTGTTGGCTCTCTTGGCc)引物對(duì)3如下：——上游引物WN3’NC—forward:5’-CAGACCACGCTACGGCG-3’;——下游引物WN3’NC—reverse:5’-CTAGGGCCGCGTGGG-3’。a)引物對(duì)1如下：b)引物對(duì)2如下：——下游引物SLE2131c:5'-GT310×10~3mol/LTris-HCl(pH8.0)、1×10-3mol/LEDTA(pH8.0)。Tris-HC150×10-3mol/L(pH8.3)、氯化鉀(KCl)50×10-3mol/L、氯化鎂(MgCl?)Tris-HCl10×10~3mol/L(pH8.4)、氯化鉀(KCl)50×10~3mol/L、氯化鎂(MgCl?)Tris54.0g、硼酸27.5g、EDTA2.9g,加水到1000mL,用5mol/L的鹽酸(HCl)調(diào)到pH8.0。每100mL溶液中含溴酚藍(lán)0.25g,蔗糖40g。將采集的蚊蟲(chóng)樣本飼養(yǎng)2d以上，待胃內(nèi)血液全部消化后將其冷凍致死。分類、分性別編號(hào)，按磨或置電動(dòng)勻漿器中勻漿20s～30s,使樣品勻漿成糊狀。勻漿放入離心管中以14000r/min離心3min,取上清液140μL加入等體積的含異硫氰酸胍和碘菌蒸餾水1.5μL,再覆蓋50μL礦物油。加人0.2mol/LEDTA終止反應(yīng)，反應(yīng)物用酚抽提，乙醇沉淀cDNA。加人PCR擴(kuò)增緩沖液，dNTP各250×10-6mol/L、正向引物和反向引物各50×10-12mol/L～100×10-12mol/L,使反應(yīng)體積4——分別取已胸內(nèi)接種感染西尼羅病毒與圣路易腦炎病毒的實(shí)用TBE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖(含0.5pg/mL溴化乙錠，EB)平板。將平板放入水平電泳DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照，推薦使用pUC19DNA/Msp(HpalI)。5V/cm電泳約0.5h,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)6.2.8結(jié)果判定6.2.8.1在紫外燈下觀察核酸帶并判斷結(jié)果。6.2.8.2PCR后陽(yáng)性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)一條DNA片段帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶。DNA片段——引物對(duì)1檢測(cè)出的病毒核酸帶在70bp位置；——引物對(duì)2檢測(cè)出的病毒核酸帶在408bp位置：——引物對(duì)3檢測(cè)出的病毒核酸帶在103bp位置。——引物對(duì)1檢測(cè)出的病毒核酸帶在393bp位置；——引物對(duì)2檢測(cè)出的病毒核酸帶在495bp位置；6.2.8.3待測(cè)樣品電泳后在相應(yīng)bp數(shù)的DNA位置上有核酸6.2.8.4無(wú)核酸帶或核酸帶的大小不是相應(yīng)bp數(shù)的為陰性。參見(jiàn)附錄A。8.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)到西尼羅病毒或圣路易腦炎病毒特異性基因，報(bào)告為采用RT-PCR法或其他檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的相應(yīng)標(biāo)本應(yīng)送指定的實(shí)驗(yàn)室做復(fù)檢或5A.1.2器材制備每隔1.0mm劃一刻度。用1個(gè)或2個(gè)圓形環(huán)，通過(guò)螺旋帽，將接種用注射針頭與一金屬柄密接。此金A.1.3.2.1包被抗體辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的黃病毒群特異性抗體(MAb6B6C-1-HRP)碳酸鈉(Na?CO?)1.59g,碳酸氫鈉(NaHCO?)2.93g,加雙蒸水至1000mL,pH9.6。氯化鈉(NaCl)8g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉<Na?HPO?·12H?O)2.9g,(KCl)0.2g,吐溫-200.5mL,疊氮化鈉(迭氮鈉)0.2g,加雙蒸水至1000mL,pH7.4,保存于4℃冰箱A.1.4.3封閉液PBS(內(nèi)含1%去脂奶粉，0.1%吐溫-20)。前以枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液(pH5.4)稀釋成0.1mg/mL,每毫升內(nèi)加入0.75%雙氧水(H?O?)4.2pL,此溶液應(yīng)在1h內(nèi)使用。2mol/L硫酸(H?SO?)b)在各孔內(nèi)加入4HAU待鑒定的病毒血凝素50μL,混勻后37℃作用1h。c)然后加入1%GRBC50μL,置微型振蕩器上混合1min,放濕盒內(nèi)室溫靜置45min～60min后凡是能被最高稀釋度的抗西尼羅病毒或抗圣路易腦炎病毒標(biāo)準(zhǔn)血清抑制其血凝反應(yīng)者，即可確定 (MAbs3.91D為1:2000,MAb4A4C-4為1:4000)后包被酶標(biāo)板，每孔中加100μL,4℃過(guò)夜或37℃孵育5h,倒出孔內(nèi)液體。A.4.2.1.2洗滌A.4.2.1.3封閉A.4.2.1.4加入待測(cè)樣品每個(gè)樣品加兩孔，每孔100μL。另將標(biāo)準(zhǔn)西尼羅病毒或圣路易腦炎病毒懸液(陽(yáng)蚊蟲(chóng)勻漿(陰性對(duì)照)和PBS-T洗液(空白對(duì)照)也各加兩孔。在加樣前，待測(cè)蚊蟲(chóng)勻漿的上清液以PBS-吐溫液(0.5%吐溫-20)室溫處理15min～30min(可降低本底或提高試驗(yàn)的敏感性)。4℃過(guò)夜或每孔加100μL0.1%的雙氧水(H?O?)(應(yīng)用雙蒸水稀釋),37℃反應(yīng)15min,倒出孔內(nèi)液體。用在每孔中加入100μL用PBS-T稀釋(1:10000)的酶標(biāo)記黃病毒群特異性抗體(MAb6B6C-1-每孔中加入100μL雙氧水(H?O?)/3,3’,5,5