2024糧油檢驗(yàn)油脂定性試驗(yàn)

2-的測(cè)定PAGEPAGE1動(dòng)植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸組分的測(cè)定范圍本文件描述了動(dòng)植物油脂的甘三酯分子2-位脂肪酸（β或內(nèi)位）組分的測(cè)定方法。本方法適用于熔點(diǎn)低于50℃在酯交換反應(yīng)開始后10分鐘內(nèi)在50℃的反應(yīng)混合物中變成液體的油脂。本方法不適于含有下列組分的油脂：——含有少于四個(gè)碳原子的脂肪酸；——含有多于二十二個(gè)碳原子的脂肪酸；——含有羥基脂肪酸（如：蓖麻油酸）。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5009.168-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定GB5009.229食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價(jià)的測(cè)定GB/T5524動(dòng)植物油脂扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T15687動(dòng)植物油脂試樣的制備術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。原理試樣中游離脂肪酸中和后，經(jīng)柱層析凈化，用酶將甘三酯水解成2-單甘酯，經(jīng)薄層層析（TLC）分離，用氣相色譜測(cè)定脂肪酸組分含量。試劑所有試劑均為分析純，水為符合GB/T6682要求的二級(jí)水。用于試樣凈化的試劑2-丙醇或乙醇：95%（體積分?jǐn)?shù)）。30℃-60℃。2-丙醇：50%（體積分?jǐn)?shù)）或乙醇：50%（體積分?jǐn)?shù)）。氫氧化鈉溶液：0.5mol/L。酚酞溶液：1g100mL95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中。260℃2hⅠ級(jí)，保存在干燥器中。氮?dú)?。用于甘三酯水解的試??72700mg/L。固定化南極假絲酵母脂肪酶（CAL-B）Moesziomycesantarctica（Candidaantarctica，Pseudozymaantarctica）。儲(chǔ)存在干燥的冰箱里。注1：商品化的CAL-B包括：Novozym435（丹麥諾維信），IM-NE100(無錫蔚藍(lán)生物），LipaseCL‘Amano’IM（日本天野），CHIRAZYMEL-2C4（瑞士羅氏診斷）或其他同等的CAL-B脂肪酶。注2：PLU（PropylLaurateUnit）是月桂酸丙酯單位，對(duì)應(yīng)于規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件下1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol月桂酸丙酯所需的酶活性的量。注3：脂肪酶制劑的活性濃度由制造商說明。2-單甘酯的試劑乙醇：95%（體積分?jǐn)?shù)）。30℃-60℃。丙酮。硅膠：含有粘合劑，用于薄層層析。展開劑：正己烷或石油醚+乙醚+98%甲酸=70+30+1。顯示劑：2’,7’-二氯熒光黃乙醇溶液（2’,7’-Dichlorofluorescein）：2g/L。100mL1滴1mol/L氫氧化鈉溶液使呈微堿性。2-單甘酯的試劑參見GB5009.168-2016的第3章。儀器用于試樣凈化的儀器30℃-40℃之間能恒溫控制。13mm400mm250mL氮吹儀：提供氮?dú)饬?。分液漏斗?00mL。圓底燒瓶：100mL。用于甘三酯水解的儀器玻璃離心管：10mL，帶有磨口玻璃塞。30-50℃±0.5℃150-180/振蕩。30-50℃±0.5℃。150–180/分速度攪拌。150-180/分速度攪拌。16-40μm。秒表。2-單甘酯的儀器200mm×200mm涂布器：用于制備薄層層析板。玻璃板：200mm×200mm。微量注射器：3μL/滴-4μL/滴。噴霧器：用于薄層層析板噴射顯示劑。微型刮鏟：用于刮下薄層層析板上單甘酯譜帶。6.3.7 103℃±2℃。254nm。圓底燒瓶：25mL，1m錐形瓶：250mL，帶有磨口玻璃塞。錐形瓶：50mL。干燥器：內(nèi)有有效的干燥劑。2-單甘酯的儀器參見GB5009.168-2016的第4章。扦樣按照GB/T5524執(zhí)行。試樣制備按GB/T15687制備試樣。操作步驟試樣酸價(jià)的測(cè)定按GB5009.229測(cè)定試樣酸價(jià)。如果酸價(jià)不高于1.5mg/g，可按9.3直接通過氧化鋁層析柱凈化試樣；如果酸價(jià)高于1.5mg/g，先按9.2在有溶劑存在的情況下用氫氧化鈉中和，然后按9.3氧化鋁層析柱凈化試樣。氫氧化鈉中和將約10g的油樣溶解于100mL（6.1.5）50mL2-丙醇或乙醇（5.1.1），幾滴酚酞溶液（5.1.5），加入中和油樣游離脂肪酸所需的氫氧化鈉溶液（5.1.4）并超量0.5%50mL（粘液和不溶于水的物質(zhì)）25mL-30mL的2-清洗中和油脂的正己烷或石油醚，直至酚酞的粉紅色消失為止。將溶液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（6.1.3）的底瓶中，在減壓條件下去除大部分正己烷或石油醚。減壓并通入氮?dú)饬鳎?.1.7）、在30℃-40℃溫度下干燥油脂，直到溶劑完全除去為止。氧化鋁層析柱凈化試樣15g已活化的氧化鋁（5.1.6）與50mL正己烷或石油醚（5.1.2）制備成懸浮液，邊振動(dòng)邊倒入層析1mm-2mm25mL油醚（5.1.2）溶解的5g油脂溶液，小心地倒入層析柱里，用100mL圓底燒瓶（6.1.6）收集從層析柱流出的洗滌液。水解甘三酯0.1g1.0g（5.2.1）（6.2.1）40-50℃的水浴鍋中，直到變?yōu)橐后w。440PLUCAL-B(5.2.2)，蓋上塞子，30℃150-180/3±3分鐘。也可以在恒溫水浴鍋中（6.2.3），采用磁性攪拌棒（6.2.4）或磁性攪拌盤（6.2.5）攪拌，攪150/30℃3±3注：在起草本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，440PLU固定化CAL-B相當(dāng)于44mgNovozym435，44mgIM-NE100或72mgCHIRAZYMEL-2C4，或38mg脂肪酶CL'Amano'IM。中除去。反應(yīng)混合物可在-20℃保存至分析。4400（PLU）的固定CAL-B脂肪酶(5.2.2)，同時(shí)確保在后續(xù)分離2-單甘酯和制備脂肪酸甲酯有足夠的樣品用于分析。2-單甘酯薄層板的制備用乙醇、正己烷或石油醚（5.3.2）和丙酮（5.3.3）小心清洗玻璃板為避免酰基轉(zhuǎn)移，硅膠板可用硼酸飽和處理。反應(yīng)混合物應(yīng)盡快進(jìn)行薄板層析分離。外，事先把制備的薄層板放在展開槽中，用溶劑展開到薄層板的頂端加以清洗。2-單甘酯的分離用微量注射器（6.3.4）將試樣提取液（9.4.5）滴在距薄層板（9.5.1）底邊15mm的位置，使細(xì)滴組成連續(xù)帶。將薄層板放入展開槽（6.3.1），展開槽事先加有展開劑（5.3.5），并已達(dá)到飽和狀態(tài)。蓋上蓋子進(jìn)行層析（層析溫度約2010mm處為止。在約20℃溫度的空氣中干燥薄層板，用噴霧器（6.3.5）將顯示劑（5.3.6）噴涂在薄層板上。在紫外光燈（6.3.8）下標(biāo)出單甘酯的譜帶（Rf值約0.035），用微型刮鏟（6.3.6）刮下，要避免刮到起點(diǎn)線上的物質(zhì)。在室溫下是液體的凈化試樣（9.3），收集的硅膠移入燒瓶（6.3.9），按9.6步驟進(jìn)行操作。在室溫下是固體的凈化試樣（9.3），收集到的硅膠移入50mL錐形瓶（6.3.11），加15mL乙醚（5.2.1），充分搖動(dòng)。把所有硅膠移入燒結(jié)玻璃過濾器（6.2.6），每次用15mL乙醚（5.2.1）沖洗過濾器（6.2.6），共三次。收集過濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（6.1.2）除去乙醚至濾液體積為4mL-5mL，將其轉(zhuǎn)（5.1.7）甘酯的量應(yīng)占該試樣量的10g/100g-30g/100g，否則要重新水解甘三酯（9.3）。2-單甘酯收集硅膠所獲得的單甘酯（或從硅膠中提取的單甘酯），按GB5009.168-2016的5.2.1.4制備脂肪酸甲酯。再按GB5009.168測(cè)定脂肪酸甲酯。結(jié)果表示計(jì)算出各種2-單甘酯占總2-單甘酯的比值，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果保留一位小數(shù)。精