《發(fā)光免疫分析技術(shù)》

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù).

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)慨述

-化學(xué)發(fā)光

-化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)

-化學(xué)發(fā)光劑

-發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型

-直接化學(xué)發(fā)光免疫分析

-化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

-電化學(xué)發(fā)光免疫分析.什么是發(fā)光免疫分析？是將發(fā)光分析和免疫反響相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。

.放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)

三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)..發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)〔較低能級(jí)〕躍遷到激發(fā)態(tài)〔較高能級(jí)〕，然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。

發(fā)光的根底知識(shí).光照發(fā)光〔photoluminescence〕指發(fā)光劑〔熒光素〕經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，其回至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長波長的光。生物發(fā)光〔bioluminescence〕是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反響底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來?；瘜W(xué)發(fā)光發(fā)光的根本類型.化學(xué)發(fā)光〔chemiluminescence〕是指伴隨化學(xué)反響過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反響時(shí)，吸收了反響過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反響的產(chǎn)物分子或反響的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光又分為：直接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光

什么是化學(xué)發(fā)光.一些化學(xué)反響能釋放足夠的能量把參加反響的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，假設(shè)被激發(fā)的是一個(gè)反響產(chǎn)物分子，那么這種反響過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反響過程簡單地描述如下：A十BC*C*C＋h·γγ為光子，C*表示C處于激發(fā)態(tài)

直接化學(xué)發(fā)光.假設(shè)激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反響的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反響過程表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ

間接化學(xué)發(fā)光.

化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù).在化學(xué)發(fā)光反響中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。

一、化學(xué)發(fā)光劑.發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的物質(zhì)相匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；其化學(xué)發(fā)光常是氧化反響的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性化學(xué)發(fā)光劑的根本條件.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反響，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。

〔一〕直接化學(xué)發(fā)光劑.一.代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反響體系的發(fā)光體。..二.另一類代表物質(zhì)：三聯(lián)吡啶釕，[RU(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺〔TPA〕在陽電極外表可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反響。三聯(lián)吡啶釕.電化學(xué)發(fā)光劑反響原理.利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑〔底物〕發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。代表物質(zhì)：魯米諾及其衍生物，AMPPD〔二〕酶促化學(xué)發(fā)光劑.魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反響原理.AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕..化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型.用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反響后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需參加氧化劑〔H2O2〕和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這局部光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析.發(fā)光YYY磁微粒子被測抗原+

抗體+丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后〔1〕參加H2O2〔pH<10〕〔2〕參加堿〔pH>10〕

直接化學(xué)發(fā)光分析--夾心法........電化學(xué)發(fā)光免疫分析〔electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA〕是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反響，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。

二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析.磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反響后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極外表時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反響，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極外表進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光強(qiáng)度與待測抗原濃度成正比。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析.電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖.以TSH為例：第一步：結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即[Ru(bpy)3]2++N羥基琥珀酰胺酯〔NHS〕的TSH抗體和結(jié)合了生物素的TSH抗體與待測血清同時(shí)參加一個(gè)反響杯中，孵育9分鐘。第二步：將被鏈霉親和素包被的磁珠參加反響杯中，再次孵育9分鐘，使生物素通過與親和素的結(jié)合將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心法。下一步，蠕動(dòng)泵將形成的[Ru(bpy)3]2+－抗體－抗原－抗體－磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測量室，此時(shí)，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極外表。同時(shí)，游離的TSH抗體〔與生物素結(jié)合的和與[Ru(bpy)3]2+結(jié)合的抗體〕也被吸出測量室。緊接著，蠕動(dòng)泵參加含三丙胺〔TPA〕的緩沖液，同時(shí)電極加電壓，啟動(dòng)ECL反響過程。發(fā)光劑[Ru(bpy)3]2+和電子供體TPA在陽極外表可同時(shí)各失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反響，使二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面，TPA被氧化成陽離子自由基TPA+q，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個(gè)質(zhì)子〔H+〕，形成自由基TPAq，這是一種很強(qiáng)的復(fù)原劑，可將一個(gè)電子給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+，使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+通過熒光機(jī)制衰減，發(fā)射出一個(gè)波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的[Ru(bpy)3]2+。該過程在電極外表周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈線性關(guān)系，故可測出待測抗原的含量。最后，終止電壓，移開磁珠，參加清洗液沖洗流動(dòng)測量室，準(zhǔn)備下一個(gè)樣品測定。....化學(xué)發(fā)光酶免疫分析〔chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA〕是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反響的酶如辣根過氧化物酶〔HRP〕或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反響后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，參加底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，處理信號(hào)計(jì)算出測定物的濃度。三、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析.該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶〔HRP〕標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反響體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反響后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶〔HRP〕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)參加魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?！惨弧矵RP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析.

HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析.該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反響體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反響后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)參加AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。〔二〕AKP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析.

AKP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析.

加樣品、磁顆粒子、試劑孵育，使反應(yīng)物結(jié)合清洗去除未結(jié)合物質(zhì)參加底物產(chǎn)生信號(hào)孵育，促使信號(hào)的產(chǎn)生信號(hào)檢測