SN2565-2010食品中賀氏菌分群檢測MPCR-DHPLC法

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)食品中志賀氏菌分群檢測GroupingdetectiomofShigellainfood—2010-12-01實(shí)施本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。1食品中志賀氏菌分群檢測MPCR-DHPLC分群檢測方法。MPCR-DHPLC快速分群檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T4789.5食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢驗(yàn)3縮略語下列縮略語適用于本文件。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。MPCRmultiplexPCRDHPLCdenaturinghighperformanceliquidchromatography變性高效液相色譜。TEAA三乙基銨乙酸鹽。4生物安全措施為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測致病菌，所有培養(yǎng)物應(yīng)小心處置。應(yīng)按照GB19489的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。25廢棄物處理和防止污染的措施5.1檢測過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。5.2檢測過程中防止交叉污染的措施按GB/T27403規(guī)定執(zhí)行。MPCR,又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。DHPLC分析技術(shù)是應(yīng)用離子對反相液相色譜原理對DNA片段進(jìn)行分離。離子對采用三乙基胺乙酸鹽緩沖溶液(TEAA),核苷酸片段分子中帶負(fù)電荷的磷酸根基團(tuán)與TEAA分子中帶正電荷的氨基發(fā)生靜電作用相互吸引，同時(shí)TEAA分子中的三個(gè)乙基與固定相Cs表面的烷基發(fā)生疏水作用力而相互吸引，通過流動相中的乙腈的梯度洗脫達(dá)到將不同大小的核苷酸片段分離。7試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑純度應(yīng)為色譜純。水為滅菌超純水，符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。7.7蛋白酶K(20mg/mL)。7.8氯化鈉溶液(NaCl):5mol/L和0.7mol/L。7.10三氯甲烷。7.11異戊醇。7.13異丙醇。7.1470%乙醇。7.15DHPLC緩沖液：緩沖溶液A為50ml.TEAA和250μL乙腈混合，加水定容至1000mL;緩沖溶液B為50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL;緩沖溶液D為75%乙腈。8主要儀器和設(shè)備8.3高速離心機(jī)：離心轉(zhuǎn)速18000g。8.4PCR超凈工作臺。38.6滅菌PCR反應(yīng)管。9方法提要與檢測程序9.1方法提要志賀氏菌屬根據(jù)生化反應(yīng)及抗原組成不同，分為A、B、C、D四個(gè)血清群(種)。A群為痢疾志賀氏菌，B群為福氏志賀氏菌，C群為鮑氏志賀氏菌，D群為宋氏志賀氏菌。本方法采用MPCR同時(shí)擴(kuò)增志賀氏菌及其四個(gè)血清群。MPCR產(chǎn)物再利用DHPLC非變性條件下的DNA分離技術(shù)，根據(jù)DNA擴(kuò)增片段長度的不同，按照從小到大順序依次洗脫核苷酸片段，從而實(shí)現(xiàn)對食品中志賀氏菌進(jìn)行快速分群MPCR-DHPLC分群檢測食品中志賀氏菌檢測流程見圖1。樣品制備增菌肉湯細(xì)菌DNA的提取MPCR擴(kuò)增DHPLC分群鑒定陰性結(jié)果可疑陽性結(jié)果陰性結(jié)果傳統(tǒng)方法確認(rèn)結(jié)果報(bào)告圖1MPCR-DHPLC法分群檢測食品中志賀氏菌流程圖410操作步驟按照GB/T4789.5進(jìn)行增菌和分離培養(yǎng)。取10.1中的增菌液1.5ml,加到1.5mL無菌離心管中，13000g離心1min;吸棄上清液，取沉淀，加567μLTE溶液(pH8.0),懸浮.加30μl.10%SDS和3μL蛋白酶K(20mg/mL),混勻，37℃溫浴1h;加100μl.氯化鈉(5mol/L),混勻，加80μLCTAB/氯化鈉溶液(10%CTAB和0.7mol/L氯化鈉),混勻，65℃溫浴10min;加等體積三氯甲烷/異戊醇(體積比為24:1),混勻，13000g離心10min;取上清液，加等體積酚/三氯甲烷/異戊醇(體積比為25:24:1),混勻，13000g離心10min;取上：清液，加0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻.13000g離心10min;取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加100μLTE溶液(pH8.0)溶解，此即為DNA溶液。若不能立即檢測，可保存于一20℃?zhèn)溆谩０赐瑯臃椒ㄖ苽潢栃詫φ站旰完幮詫φ站甑脑鼍耗０錎NA。也可使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒并按其說明制備模板DNA。10.3DNA濃度和純度的測定取5μLDNA溶液加水梯度稀釋至1ml.,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測260nm和280nm處的光密度值。DNA的濃度按照式(1)計(jì)算：c=A×.N×50/1000……………(1)A------260nm處的吸光值；N-一核酸稀釋倍數(shù)。10D2omm=50μg/mL雙鏈DNA。當(dāng)OD2so/OD2s比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。10.4.2反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min;94℃變性60s,60℃退火60s,72℃延伸60s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min,4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。10.4.3將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析。注：PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。10.5DHPLC檢測10.5.1.1色譜柱：PS-DVB&C。DNAScp色譜柱(4.6mm×50mm,粒度3μm)。10.5.1.3流動相(體積比):5SN/T2565-2010——0.0min,55.0%緩沖溶液A,45.0%緩沖溶液B;——0.5min,50.2%緩沖溶液A,49.8%緩沖溶液B;---4.3min,40.9%緩沖溶液A,59.1%緩沖溶液B;-—8.0min,37.3%緩沖溶液A,62.7%緩沖溶液B;——11.8min,35.5%緩沖溶液A,64.5%緩沖溶液B;——15.5min,34.3%緩沖溶液A,65.7%緩沖溶液B。測靈敏度：在波長350nm積分2s)。10.5.2.1將裝有PCR產(chǎn)物的反應(yīng)管放置在DHPLC金屬板的微孔中。10.5.2.2登錄DHPLC分析系統(tǒng)，按照10.4.1設(shè)置DHPLC分析條件，建立檢測程序并運(yùn)行。注：DHPLC分析條件可根據(jù)DIPLC儀器型號的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。10.6質(zhì)控對照設(shè)置檢測過程中應(yīng)分別設(shè)陽性對照和陰性對照。陽性對照為福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，陰性對照為大腸埃希氏菌等非目標(biāo)致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株。11結(jié)果及判斷11.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)11.1.1陰性對照：無吸收峰出現(xiàn)。11.1.2陽性對照：出現(xiàn)典型的PCR產(chǎn)物吸收峰，且峰吸收值大于3mV。11.1.3不符合上述對照質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的視為無效。11.2結(jié)果判定與報(bào)告11.2.1檢測結(jié)果判定11.2.1.1福氏志賀氏菌經(jīng)MPCR可擴(kuò)增出629bp和263bp兩個(gè)片段的產(chǎn)物，DHPLC檢測出該兩個(gè)PCR產(chǎn)物陽性吸收峰。11.2.1.2宋氏志賀氏菌經(jīng)MPCR可擴(kuò)增出629bp和104bp兩個(gè)片段的產(chǎn)物，DHPLC檢測出該兩個(gè)PCR產(chǎn)物陽性吸收峰。11.2.1.3鮑氏志賀氏菌經(jīng)MPCR可擴(kuò)增出629bp和237bp兩個(gè)片段的產(chǎn)物，DHPLC檢測出該兩個(gè)PCR產(chǎn)物陽性吸收峰。11.2.1.4痢疾志賀氏菌經(jīng)MPCR可擴(kuò)增出629bp和173bp的兩個(gè)片段的產(chǎn)物，DHPLC檢測出該兩個(gè)PCR產(chǎn)物陽性吸收峰。注：鮑氏志賀氏菌引物與部分大腸埃希氏菌有交叉反應(yīng)，DHPLC檢測大腸埃希氏菌S88、55989、E24377A、O55:H6、O155、O59、O127:H6等會出現(xiàn)237bp的PCR單一產(chǎn)物吸收峰。11.2.2結(jié)果報(bào)告11.2.2.1檢測樣品無典型PCR產(chǎn)物陽性吸收峰出現(xiàn)，可判定樣品結(jié)果為陰性，直接報(bào)告未檢出×××志賀氏菌。611.2.2.2檢測樣品出現(xiàn)典型的PCR產(chǎn)物陽性吸收峰，出峰時(shí)間與陽性對照一致，且吸收峰值大于3mV時(shí)，可判定該樣品結(jié)果為×××志賀氏菌可疑陽性。11.2.2.3檢測樣品出現(xiàn)典型的PCR產(chǎn)物陽性吸收峰，但吸收峰值小于3mV時(shí)，建議樣本重做。重做結(jié)果峰吸收值仍小于3mV則為×××志賀氏菌陰性，否則為×××志賀氏菌可疑陽性。11.2.2.4對于可疑×××志賀氏菌陽性結(jié)果，應(yīng)參見GB/T4789.5做進(jìn)一步的生化鑒定和報(bào)告。