T-SHZSAQS 00227-2023 乳肉兼用牛ACACA基因標(biāo)記輔助分子育種技術(shù)規(guī)范

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65.020.30學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載CCS

B

40 T/SHZSAQS

—2023乳肉兼用牛

ACACA

基因標(biāo)記輔助分子育種技術(shù)規(guī)范 石河子市質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) 發(fā)

布學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00227—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 前言

................................................................................

II1

..............................................................................

12 規(guī)范性引用文件

....................................................................

13 術(shù)語(yǔ)和定義

........................................................................

13.1

分子育種..........................................................................

13.2

標(biāo)記輔助選擇......................................................................

13.3ACACA

基因.........................................................................

13.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

..............................................................

24 主要儀器

..........................................................................

25 主要試劑和材料

....................................................................

26 樣本采集

..........................................................................

27 試驗(yàn)步驟（ACACA

基因標(biāo)記輔助分子育種方法）.......................................

27.1

基因組

DNA

提取和質(zhì)檢..............................................................

27.2PCR

引物序列.......................................................................

27.3PCR

反應(yīng)體系.......................................................................

27.4PCR

擴(kuò)增程序.......................................................................

27.5PCR

產(chǎn)物電泳檢測(cè)...................................................................

37.6SSCP

多態(tài)性分析....................................................................

38 結(jié)果判定

..........................................................................

39 廢棄物處理

........................................................................

310

安全防護(hù)...........................................................................

311

注意事項(xiàng)...........................................................................

3附錄

A (資料性）.....................................................................

4學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00227—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 本文件參照

GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第

1

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。津市武清大孟莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心。武少軍、葉翠芳。II學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00227—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載乳肉兼用牛

1 范圍本文件規(guī)定了乳肉兼用牛ACACA基因標(biāo)記輔助分子育種的術(shù)語(yǔ)與定義及主要ACACA基因標(biāo)記輔助分子育種ACACA基因標(biāo)記輔助分子育種。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期適用于本文件。GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

19495.2 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求DB11T150.1 奶牛飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范

第

1

部分：育種3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1

分子育種分子育種技術(shù)是對(duì)影響主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因進(jìn)行定位，也就是在

DNA

水平上直接選擇，這樣就消除了各種內(nèi)外環(huán)境因素的影響。3.2

標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇是一種充分利用家系，表型性狀和遺傳標(biāo)記信息來(lái)選育品種的一種方法。標(biāo)記輔助選擇應(yīng)具備以下條件：（1）群體中要存在多態(tài)性且為高度多態(tài)，2穩(wěn)定性；（3）不會(huì)引起目標(biāo)性狀的表效應(yīng)；（4）遺傳標(biāo)記易于檢測(cè)和識(shí)別。3.3

ACACA

基因乙酰輔酶A羧化酶α

基因位于19289kbp合成中起重要調(diào)控作用。兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00227—2023兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載3.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析是利用DNA或RNA分析技術(shù)，用以分析遺傳學(xué)特征和基因突變。4 主要儀器主要儀器包括：PCR泳槽電泳儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)儀、多功能酶標(biāo)儀、恒溫?fù)u床、可調(diào)式微量移液器、分光光度計(jì)。試驗(yàn)室用水、試驗(yàn)室質(zhì)量管理應(yīng)符合GB/T6682、、DB11T150.1相關(guān)要求。5 主要試劑和材料主要試劑和材料包括：2×PCR

Master

Mix、2×MarkerⅠ、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）。6 樣本采集使用含有EDTA1-3mL下顛倒混勻，在采血管壁上清晰記錄牛號(hào)。樣本保存于℃環(huán)境下待用。7 試驗(yàn)步驟（ACACA

基因標(biāo)記輔助分子育種方法）7.1

DNA

提取和質(zhì)檢參照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)試驗(yàn)樣品血液提取DNA，用超微量紫外可見分光光度計(jì)（NanoDrop

2000型）和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。7.2

引物序列上游引物：F:CTCTGCTCCTGGTAGGCATC，下游引物：R:ACAGACCCATTCAGGCAAAC，超純水溶解、稀釋引物，-20℃保存。7.3

反應(yīng)體系2×PCR

Master

Mix

μ

L，10μ

mol/L上游引物、下游引物各0.4μ

L，μ

LDNA

0.5μ

L，

6.2μ

L。7.4

擴(kuò)增程序兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00227—2023兔學(xué)兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載94℃預(yù)變性5min；95℃變性30

s；58℃退火30s，72℃延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min；4℃保存。7.5

產(chǎn)物電泳檢測(cè)取PCR產(chǎn)物4μ

L與DNA

Buffer2%30min，電泳結(jié)束后，在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)下查看結(jié)果、拍照，并分析7.6

SSCP

多態(tài)性分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.5μ

L與DNA上樣緩沖液8μ

L于EP管中混合均勻，9810min℃冰箱內(nèi)5min10μ

L上樣液于非變性聚丙烯酰胺（Acr：Bis=37.5：1）中，200

V預(yù)電泳20min后，100V過(guò)夜電泳。電泳結(jié)束后銀染顯色，并在白色燈箱上拍照保存。8 結(jié)果判定ACACA基因PCR擴(kuò)增條帶為441bp，且條帶清晰無(wú)雜帶（附圖1）。PCR-SSCP分析和測(cè)序可見ACACAg.13437429

A>T存在AA和TT2和3經(jīng)基因多態(tài)性與泌乳性能關(guān)聯(lián)分析，ACACAAA型為優(yōu)勢(shì)基因型，AA型的總產(chǎn)奶量和乳蛋白率顯著高于TTACACA基因，可以作為分子標(biāo)記為荷斯坦奶牛及乳肉兼用牛選育提供科學(xué)依據(jù)。9 廢棄物處理廢棄物處理應(yīng)符合、DB11T150.1相關(guān)要求。10 安全防護(hù)安全防護(hù)應(yīng)符合、DB11T150.1相關(guān)要求。11 注意事項(xiàng)11.1

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)用的試劑和操作流程應(yīng)建立完整有效的質(zhì)量安全管理體系。1