從乳糖酶不耐受到酶的固定化

從乳糖酶不耐受到酶的固定化指導(dǎo)老師：xxx：-1乳糖酶的介紹2乳糖酶的調(diào)控3重點(diǎn)！4乳糖酶的固定從乳糖酶不耐受到酶的固定化乳糖酶的介紹很多人由于小腸上皮細(xì)胞乳糖酶缺乏，飲用牛奶后乳糖不能被分解吸收，乳糖進(jìn)入結(jié)腸后，被腸道細(xì)菌分解，產(chǎn)生大量乳酸、甲酸等短鏈脂肪酸和氫氣，造成滲透壓升高，使腸腔中的水分增多，引起腹脹、腸鳴、腸絞痛直至腹瀉等現(xiàn)象，這在醫(yī)學(xué)上稱為乳糖不耐癥(lactoseintolerance，LI)乳糖不耐癥與乳糖吸收不良合稱為乳糖酶缺乏(lactasedeficiency，LD)。乳糖酶缺乏是一種廣泛存在的世界性問(wèn)題，影響了全世界近2/3的人口，亞洲患病率高達(dá)95%，LD對(duì)人類的健康造成很大的威脅，尤其是青少年人體腸道乳糖酶的來(lái)源主要是靠機(jī)體自身合成、腸道內(nèi)益生菌的少量合成并分泌和服用外源乳糖酶補(bǔ)充乳糖酶的調(diào)控乳糖酶的調(diào)控腸道乳糖酶缺乏癥因?yàn)槭腔蛟驅(qū)е?，目前沒(méi)有根治的方法。因此腸道乳糖酶的調(diào)控技術(shù)顯得格外重要。腸道乳糖酶的調(diào)控技術(shù)主要有以下幾類第一類:積極治療原發(fā)病，避免使用損害乳糖酶活性的藥物禁止濫用抗生素，不恰當(dāng)?shù)厥褂每股啬芤种普５囊嫔悍敝?，妨礙腸道微生物對(duì)乳糖的代謝作用，從而加重乳糖不耐受癥狀。促進(jìn)腸上皮細(xì)胞修復(fù)及乳糖酶活性的恢復(fù)，如補(bǔ)充葉酸、鋅制劑等。此類方法主要是針對(duì)小腸黏膜彌漫性病變引起的繼發(fā)性乳糖酶缺乏癥第二類:已有研究表明某些中藥復(fù)方能夠治療腹瀉，其原因是增強(qiáng)了乳糖酶的活性張曉利等通過(guò)研究白頭翁復(fù)方對(duì)腹瀉小鼠腸道黏膜乳糖酶活性的影響，研究說(shuō)明白頭翁復(fù)方能夠顯著增強(qiáng)腹瀉小鼠腸道黏膜上乳糖酶的活性，表明白頭翁復(fù)方治療腹瀉的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)乳糖酶的活性有關(guān)乳糖酶的調(diào)控第三類:直接補(bǔ)充乳糖酶和生產(chǎn)低乳糖制品口服外源性的乳糖酶和用乳糖酶水解乳糖來(lái)生產(chǎn)低乳糖或無(wú)乳糖乳制品以輔助乳糖消化吸收是目前廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)某些細(xì)菌、酵母菌和真菌也能合成乳糖酶目前，國(guó)際市場(chǎng)的乳糖酶產(chǎn)品，一種是乳酸克魯維酵母制備的乳糖酶，另一種是米曲霉制備的真菌乳糖酶比較成熟的是乳酸克魯維酵母發(fā)酵的乳糖酶，這種乳酸酵母最先是由伯約尼克1889年發(fā)現(xiàn)的隨著1950年發(fā)現(xiàn)了乳糖不耐癥的病因，1960年研制出乳糖酶，才得以應(yīng)用乳糖酶日攝入量不受限制，已由FDA和JACFA等權(quán)威評(píng)審機(jī)構(gòu)確認(rèn)為安全物質(zhì)乳糖酶的調(diào)控7上述所述乳糖酶產(chǎn)品最適溫度均在37℃左右，對(duì)于生產(chǎn)低乳糖制品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸并不利，低溫乳糖酶具有中溫乳糖酶無(wú)法達(dá)到的優(yōu)越性，多數(shù)學(xué)者開(kāi)始從低溫壞境中分離乳糖酶產(chǎn)生菌，通過(guò)16SrRNA序列分析可知，多數(shù)低溫乳糖酶產(chǎn)生菌屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)和交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)，隨著研究的深入，低溫乳糖酶的生產(chǎn)成本也將大幅降低同時(shí)將乳糖酶固定化后生產(chǎn)低乳糖制品也受到了多數(shù)酶學(xué)專家的關(guān)注，既能提高生產(chǎn)效率，也能明顯降低生產(chǎn)成本重點(diǎn)！重點(diǎn)！1234乳糖酶作為一種食品添加劑,在乳品工業(yè)中應(yīng)用廣泛但乳糖酶的實(shí)際應(yīng)用企業(yè)數(shù)量少,在實(shí)際應(yīng)用中的復(fù)雜條件限制了乳糖酶的應(yīng)用范圍,如乳糖酶由于胃液的酸性和蛋白酶的作用而喪失活性,工業(yè)應(yīng)用中反應(yīng)條件復(fù)雜導(dǎo)致乳糖酶的重復(fù)性使用次數(shù)少、穩(wěn)定性低等缺點(diǎn)可用于GOS的生產(chǎn)[5]、無(wú)乳糖/低乳糖牛奶的生產(chǎn)[6]、乳制品副產(chǎn)物乳清的降解[7?8]、低乳糖冰激凌的生產(chǎn)[9]等乳糖酶固定化技術(shù)的發(fā)展為克服以上難題提供了有效途徑重點(diǎn)！乳糖酶固定化技術(shù)的發(fā)展為克服以上難題提供了有效途徑固定化乳糖酶是將乳糖酶和載體相互結(jié)合在一起,控制反應(yīng)在一定的空間范圍內(nèi),固定化乳糖酶有利于回收后的重復(fù)使用和提高乳糖酶穩(wěn)定性傳統(tǒng)乳糖酶固定化方法較高的生產(chǎn)成本和較低的乳糖酶固定化效率限制了乳糖酶固定化載體材料的商業(yè)應(yīng)用隨著新材料和生物技術(shù)的發(fā)展,乳糖酶固定化效率有了一定程度的提高,越來(lái)越多應(yīng)用于乳品工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域乳糖酶的固定4乳糖酶的固定1傳統(tǒng)乳糖酶固定方法固定化酶技術(shù)是利用有機(jī)或無(wú)機(jī)固體材料把酶分子限定在一定區(qū)域內(nèi),同時(shí)不影響酶催化活性,使酶能夠連續(xù)重復(fù)使用的技術(shù)[10]?？捎行岣呙傅氖褂眯?、增加酶的穩(wěn)定性、控制催化反應(yīng)的啟動(dòng)和終止。乳糖酶可通過(guò)物理和化學(xué)方法固定,物理方法包括吸附法、包埋法,化學(xué)方法包括共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法[11]乳糖酶的固定固定化酶技術(shù)是利用有機(jī)或無(wú)機(jī)固體材料把酶分子限定在一定區(qū)域內(nèi),同時(shí)不影響酶催化活性,使酶能夠連續(xù)重復(fù)使用的技術(shù)[10]?？捎行岣呙傅氖褂眯?、增加酶的穩(wěn)定性、控制催化反應(yīng)的啟動(dòng)和終止。乳糖酶可通過(guò)物理和化學(xué)方法固定,物理方法包括吸附法、包埋法,化學(xué)方法包括共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法[11]吸附法是通過(guò)酶與載體間的相互作用,實(shí)現(xiàn)固定化過(guò)程,依據(jù)酶和載體作用方式,可分為物理吸附、靜電吸附、親和吸附和疏水吸附[12]。這種作用力不牢固,酶易脫落。乳糖酶一般溶解在緩沖溶液中,經(jīng)過(guò)足夠長(zhǎng)的時(shí)間孵化,促進(jìn)乳糖酶和載體的相互作用吸附法是將酶固定在載體上的最簡(jiǎn)單的方法,這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以最大限度地保留酶活性且操作簡(jiǎn)單。CARPIO等[13]將乳糖酶和淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶吸附固定在骨粉上,所有的酶活性都被保留。將乳糖酶吸附在DuoliteA568樹(shù)脂上時(shí),相互作用120min后,可以達(dá)到幾乎100%的酶活性[14]乳糖酶的固定1JOVANOVIC等[16]使用該法固定乳糖酶,用于乳清中GOS的合成。固定化乳糖酶經(jīng)過(guò)7次重復(fù)使用后保留95%活性。乳糖酶的微囊固定方法是包埋法的一種,乳糖酶通常包埋在生物聚合物微囊中[17]2共價(jià)結(jié)合固定法是在酶和載體之間通過(guò)共價(jià)鍵形成牢固的連接,從而最大限度地減少酶從載體中泄漏引起的活性損失[18]。共價(jià)結(jié)合是酶與載體結(jié)合最有效和最穩(wěn)定的方法之一,它可以防止蛋白質(zhì)洗脫到溶液中3然而,共價(jià)方法可能相對(duì)昂貴且復(fù)雜,因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下,載體材料需要初步活化[19]。其次,共價(jià)反應(yīng)激烈會(huì)導(dǎo)致酶活損失,可以通過(guò)保護(hù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)延長(zhǎng)其壽命[20]。乳糖酶的共價(jià)結(jié)合是通過(guò)將蛋白質(zhì)的游離氨基和載體共價(jià)結(jié)合,使乳糖酶和載體之間形成牢固的連接[21]4交聯(lián)法是利用酶自身的雙功能團(tuán)結(jié)構(gòu),加入交聯(lián)劑(如戊二醛、乙烯共聚物、馬來(lái)酰亞胺)連接起來(lái)的一種固定方法,可使酶和載體間鍵合,也可在無(wú)載體情況下,使酶分子間形成聚合物[22]。該法操作成本低,能防止酶泄露,交聯(lián)反應(yīng)可能發(fā)生在酶的活性中心,從而使酶活降低或失活,降低固定化酶的回收率乳糖酶的固定交聯(lián)法通常與其他固定化方法結(jié)合以提高固定化效果。FREITAS等[23]通過(guò)將乳糖酶在海藻酸鈉和明膠中包埋并與戊二醛交聯(lián)來(lái)提升固定化乳糖酶的穩(wěn)定性。固定化乳糖酶使用25次后,酶活性降低了20%在實(shí)際應(yīng)用時(shí),為了提高固定化乳糖酶的使用效率,有時(shí)將兩種或兩種以上的固定化方法并用,如吸附-交聯(lián)、包埋-交聯(lián)、吸附-包埋-交聯(lián)。通過(guò)吸附法可以提高乳糖酶的固定化率,在通過(guò)包埋-交聯(lián)相結(jié)合的方法增加結(jié)合強(qiáng)度,解決乳糖酶泄露和固定化乳糖酶操作穩(wěn)定性問(wèn)題乳糖酶的固定2新興乳糖酶固定方法2.1交聯(lián)酶聚集體技術(shù)交聯(lián)酶聚集體(cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs)技術(shù)被認(rèn)為是一種有效的無(wú)載體固定化方法[24]。通常向酶的水溶液中加入蛋白沉淀劑(如硫酸銨),使酶沉淀析出形成非共價(jià)鍵連接的聚集體,加入交聯(lián)劑與酶產(chǎn)生交聯(lián),離心收集沉淀后,用緩沖溶液洗滌[25]乳糖酶的固定交聯(lián)酶聚集體(cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs)技術(shù)被認(rèn)為是一種有效的無(wú)載體固定化方法[24]。通常向酶的水溶液中加入蛋白沉淀劑(如硫酸銨),使酶沉淀析出形成非共價(jià)鍵連接的聚集體,加入交聯(lián)劑與酶產(chǎn)生交聯(lián),離心收集沉淀后,用緩沖溶液洗滌[25]CLEAs操作簡(jiǎn)單且可使用粗酶提取物和共同固定化多種不同酶(如圖1),CLEAs可由兩種或兩種以上的酶共同固定化以獲得更強(qiáng)的催化能力[26]。所得的CLEAs能有效提高酶在應(yīng)用中的穩(wěn)定性和回收率。盡管該技術(shù)已應(yīng)用于各種酶,但交聯(lián)效率不高、大分子底物的傳質(zhì)阻力等限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[27]乳糖酶的固定乳糖酶的固定2.2透性化細(xì)胞大多數(shù)乳糖酶以胞內(nèi)酶形式存在,透性化細(xì)胞不需要對(duì)乳糖酶進(jìn)行純化,同時(shí)避免乳糖酶在固定化中的活性損失。透性化細(xì)胞主要通過(guò)改變細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性,使得小分子可以自由出入細(xì)胞,通常用乙醇處理含有胞內(nèi)酶的細(xì)胞,使得葡萄糖、乳糖、半乳糖和GOS等底物與產(chǎn)物能自由進(jìn)出細(xì)胞乳糖酶的固定GOBINATH等[30]以植物乳桿菌來(lái)源的乳糖酶生產(chǎn)GOS,探究了乙醇、正丁醇透性化處理對(duì)活性的影響,優(yōu)化透性化處理過(guò)程后,乳糖酶活性提升近2倍乳糖酶的固定2.3定向技術(shù)定向技術(shù)能避免酶分子與載體無(wú)序性連接,通過(guò)蛋白融合標(biāo)簽等方法實(shí)現(xiàn)酶蛋白與載體特定位點(diǎn)的定向結(jié)合,避免活性位點(diǎn)在隨機(jī)連接中被破壞,通過(guò)蛋白融合實(shí)現(xiàn)定向共價(jià)固定化,同時(shí)將目標(biāo)酶與標(biāo)簽蛋白共同表達(dá)乳糖酶的固定定向技術(shù)能避免酶分子與載體無(wú)序性連接,通過(guò)蛋白融合標(biāo)簽等方法實(shí)現(xiàn)酶蛋白與載體特定位點(diǎn)的定向結(jié)合,避免活性位點(diǎn)在隨機(jī)連接中被破壞,通過(guò)蛋白融合實(shí)現(xiàn)定向共價(jià)固定化,同時(shí)將目標(biāo)酶與標(biāo)簽蛋白共同表達(dá)MERLO等[33]使用了一種具有固定和自識(shí)別功能的蛋白標(biāo)簽(anchoringandself-labellingproteintag,AGT)用于在大腸桿菌外膜上標(biāo)記和表面固定酶,將β-糖苷酶固定在大腸桿菌表面,在不影響酶催化活性的情況下,構(gòu)建了具有催化功能的融合蛋白,一步完成了酶的表達(dá)和自固定化,為乳糖酶的自固定化提供了參考乳糖酶的固定ANDRAD