平板電泳儀校準(zhǔn)規(guī)范

JJF1654—20171平板電泳儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于平板電泳儀(水平板電泳儀和垂直板電泳儀)計(jì)量性能的校準(zhǔn),對(duì)于其他類型的電泳儀,可參照本規(guī)范執(zhí)行。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJG124—2005電流表、電壓表、功率表及電阻表JJF1071—2010國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則GB/T29248—2012基礎(chǔ)電泳裝置凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3術(shù)語(yǔ)和計(jì)量單位3.1漂移drift在規(guī)定的工作條件下,單位時(shí)間內(nèi)電泳儀輸出電壓或電流的變化量。3.2電泳譜帶electrophoresisspectrum電泳后載體上的樣品所形成的條帶。3.3遷移距離migrationlength規(guī)定電泳條件下電泳譜帶中心和加樣孔中心的距離,單位毫米。4概述電泳是指在分散體系中,荷電粒子在外加電場(chǎng)的作用下,向電極定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳儀是利用帶電粒子如核酸、蛋白等物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同,在同一電場(chǎng)條件下其移動(dòng)方向和遷移率不盡相同的原理實(shí)現(xiàn)對(duì)帶電粒子分離與鑒定的儀器。平板電泳儀通常分為水平板和垂直板兩類,一般由電源、電泳槽等主要部件以及制膠、冷卻部分等輔助部件組成。5計(jì)量特性5.1示值誤差5.2漂移5.3遷移距離重復(fù)性6校準(zhǔn)條件6.1環(huán)境條件JJF1654—20172環(huán)境溫度:(15~35)℃。相對(duì)濕度:不大于75%。6.2校準(zhǔn)設(shè)備及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6.2.1電源校準(zhǔn)裝置經(jīng)檢定合格的標(biāo)準(zhǔn)電壓表、標(biāo)準(zhǔn)電流表。最小分辨力:電壓≤0.1V,電流≤0.1mA。6.2.2有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)300bp片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Ur≤3%,k=2);細(xì)胞色素C相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(U≤20,k=2)。6.2.3游標(biāo)卡尺經(jīng)檢定合格的游標(biāo)卡尺,分度值(分辨力)≤0.05mm。7校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法7.1示值誤差7.1.1輸出電壓示值誤差按照?qǐng)D1方式連接電路,將平板電泳儀電源設(shè)為恒壓模式,依次測(cè)定最大工作電壓的10%、20%、30%、50%、80%時(shí)輸出電壓,每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)分別重復(fù)測(cè)量3次,計(jì)算其算術(shù)平均值,按公式(1)計(jì)算輸出電壓示值誤差。(1)式中:(1)式中:ΔU—平板電泳儀輸出電壓示值誤差,V;U—平板電泳儀輸出電壓示值,V;Us—平板電泳儀輸出電壓實(shí)測(cè)值的平均值,V。圖1電壓測(cè)試電路示意圖7.1.2輸出電流示值誤差按照?qǐng)D2方式連接電路,將電泳儀電源設(shè)為恒流模式,依次測(cè)定電源最大工作電流10%、20%、30%、50%、80%處的輸出電流,每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)分別重復(fù)測(cè)量3次,計(jì)算其算術(shù)平均值,按公式(2)計(jì)算輸出電流示值誤差。3圖2電流測(cè)試電路示意圖(2)式中:ΔI=I-Is(2)ΔI—平板電泳儀輸出電流示值誤差,mA;I—平板電泳儀輸出電流示值,mA;Is—平板電泳儀輸出電流實(shí)測(cè)值的平均值,mA。7.2漂移按照?qǐng)D2方式連接電路,將平板電泳儀電源的輸出電壓(電流)設(shè)定為150V(50mA),采用電壓表(電流表)監(jiān)測(cè)其30min內(nèi)的電壓(電流)變化,記錄電壓表(電流表)顯示的最大值和最小值。按公式(3)計(jì)算電壓(電流)的漂移。式中:X=Xmax-Xmin(3)X—電壓(電流)的漂移;Xmax—最大電壓(電流);Xmin—最小電壓(電流)。7.3遷移距離重復(fù)性7.3.1水平板電泳儀將瓊脂糖凝膠和適量1×濃度的瓊脂糖凝膠電泳緩沖液放入電泳槽,電泳緩沖液以高出凝膠表面(1~2)mm為宜。取濃度為10ng/μL片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液32μL與5×DNA上樣緩沖液8μL均勻混合配制工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取5μL工作標(biāo)準(zhǔn)溶液加載到膠孔中,平行加載6個(gè)樣品孔,蓋好電泳槽蓋子。根據(jù)電泳槽大小按7V/cm的標(biāo)準(zhǔn)選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷?運(yùn)行30min或當(dāng)色素距凝膠前端約1/5處時(shí),停止電泳。隨后將凝膠樣品放在成像系統(tǒng)下成像(如果之前沒(méi)有加入染料,在進(jìn)行此步驟之前需要將凝膠放入適當(dāng)染料中染色30min)。按公式(4)計(jì)算片段DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜帶的平均遷移距離重復(fù)性(RSD)。RSD=1×d(di-1×di=1n-1×100%(4)JJF1654—20174式中:di—i泳道標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)遷移距離,mm;n—泳道數(shù);d—標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜帶的平均遷移距離,mm。7.3.2垂直板電泳儀將SDS-聚丙烯酰胺凝膠放入垂直板電泳儀,加入適當(dāng)1×濃度的Tris-Glycine電泳緩沖液,以高出凝膠表面(1~2)mm為宜。將細(xì)胞色素C相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液與0.1%溴酚藍(lán)溶液1∶1混合,100℃加熱5min,將混合溶液離心10s后平行加入6個(gè)樣品孔中,每孔10μL。選擇80V電壓開(kāi)始電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入分離膠后,電壓提高至120V,當(dāng)溴酚藍(lán)條帶接近凝膠前端約1/5處時(shí)停止電泳,從電泳槽中取出凝膠,采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染膠。隨后將樣品放在成像系統(tǒng)下成像并按公式(4)計(jì)算細(xì)胞色素C相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜帶的遷移距離重復(fù)性。8校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)經(jīng)校準(zhǔn)后的平板電泳儀應(yīng)填發(fā)校準(zhǔn)證書(shū),校準(zhǔn)證書(shū)應(yīng)符合JJF1071—2010中5.12的要求。校準(zhǔn)證書(shū)至少包括以下信息:a)標(biāo)題,如“校準(zhǔn)證書(shū)”或“b)實(shí)驗(yàn)室名稱和地址;c)進(jìn)行校準(zhǔn)的地點(diǎn)(如果不在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行校準(zhǔn));d)證書(shū)或報(bào)告的唯一性標(biāo)識(shí)(如編號(hào)),每頁(yè)及總頁(yè)數(shù)的標(biāo)識(shí);e)送校單位的名稱和地址;f)被校對(duì)象的描述和明確標(biāo)識(shí);g)進(jìn)行校準(zhǔn)的日期,如果與被校結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí),應(yīng)說(shuō)明被校對(duì)象的接受日期;h)如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí),應(yīng)對(duì)抽樣程序進(jìn)行說(shuō)明;i)對(duì)校準(zhǔn)所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標(biāo)識(shí),包括名稱及代號(hào);j)本次校準(zhǔn)所用測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說(shuō)明;k)校準(zhǔn)環(huán)境的描述;l)校準(zhǔn)結(jié)果及測(cè)量不確定度的說(shuō)明;m)校準(zhǔn)證書(shū)或校準(zhǔn)報(bào)告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等效標(biāo)識(shí)以及簽發(fā)日期;n)校準(zhǔn)結(jié)果僅對(duì)被校對(duì)象有效地聲明;o)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室書(shū)面批準(zhǔn),不得部分復(fù)制證書(shū)或報(bào)告的聲明。9復(fù)校時(shí)間間隔平板電泳儀復(fù)校間隔建議一般不超過(guò)1年。由于復(fù)校時(shí)間間隔的長(zhǎng)短是由儀器的使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等諸因素所決定的,因此,送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔。如果對(duì)儀器的檢測(cè)數(shù)據(jù)有懷疑或儀器更換主要部件及修理后應(yīng)對(duì)儀器重新校準(zhǔn)。JJF1654—20175附錄A水平板電泳儀校準(zhǔn)溶液的配制A.11×瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的配制準(zhǔn)確稱取10.8g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、5.5g硼酸、4mL0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0),加入超純水(18.2MΩ·cm)溶解定容至1000mL。A.2瓊脂糖凝膠的配制A.2.1將干凈的膠床、膠板,形成一個(gè)膠模放置在水平平面上。A.2.2根據(jù)膠板的體積[膠厚取(5~7)mm],取適量1×電泳緩沖液,并按2%(W/V)的濃度稱取相應(yīng)質(zhì)量的瓊脂糖,加熱煮沸、振搖2~3次,使瓊脂糖充分融化,直至溶液清澈透明。A.2.3當(dāng)凝膠溫度降至60℃左右時(shí),加入適量的GELRED(1∶10000;V/V),搖勻并倒入膠模中,除掉氣泡,插入梳子。A.2.4室溫下靜置待凝膠完全凝固后拔出梳子,將膠板放入電泳槽中。JJF1654—20176附錄B垂直板電泳儀校準(zhǔn)溶液的配制B.11×Tris-Glycine電泳緩沖液的配制準(zhǔn)確稱取3.02g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、18.8g甘氨酸、1g十二烷基硫酸鈉(SDS),加超純水(18.2MΩ·cm)溶解定容至1000mL。B.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配制B.2.1根據(jù)表B.1配置凝膠儲(chǔ)備液,4℃保存?zhèn)溆?。表B.1SDS-聚丙烯酰胺凝膠儲(chǔ)備液溶液名稱儲(chǔ)備液丙烯酰胺混合液(A液)29.2g丙烯酰胺;0.8g甲叉雙丙烯酰胺;加超純水(18.2MΩ·cm)至100mL分離膠緩沖液(B液)75mL2mol/LTris-HCl(pH8.8);4mL10%十二烷基磺酸鈉(SDS);21mL超純水(18.2MΩ·cm)堆積膠緩沖液(C液)50mL1mol/LTris-HCl(pH6.8);4mL10%十二烷基磺酸鈉(SDS);46mL超純水(18.2MΩ·cm)注:丙烯酰胺是神經(jīng)毒素,應(yīng)避免沾濺到皮膚,操作時(shí)必須戴手套。B.2.2分離膠:取5mLA液、2.5mLB液及2.5mL蒸餾水在燒瓶?jī)?nèi)混合均勻,隨后加入10%過(guò)硫酸銨溶液50μL和四甲基乙二胺5μL,輕輕攪拌使其均勻混合。B.2.3將分離膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內(nèi),凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm時(shí)停止,在分離膠溶液上覆蓋一層(1~5)mm的水層,使凝膠表面變得平整,靜置(30~60)min,使凝膠聚合。B.2.4堆積膠:取2.7mLA液、2.5mLC液和4.8mL蒸餾水在燒瓶?jī)?nèi)混合均勻,隨后加入10%過(guò)硫酸銨溶液50μL和四甲基乙二胺5μL輕輕攪拌使其混勻混合。B.2.5將堆積膠溶液用吸管加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。將梳子插入凝膠內(nèi)至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊(必須確保梳子齒的末端沒(méi)有氣泡,將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產(chǎn)生)。凝膠聚合30min后拔出梳子,注意不要將加樣孔撕裂。JJF1654—20177s=(s=(nU-iU)2=0.7V(C.2)實(shí)際校準(zhǔn)時(shí)在規(guī)定條件下連續(xù)測(cè)量3次,以3次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值作為結(jié)果,不確定度計(jì)算引用10次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差,則其不確定度分量為:電壓示值誤差校準(zhǔn)的不確定度評(píng)定示例C.1電壓示值誤差的測(cè)量模型式中:ΔU—式中:ΔU—平板電泳儀輸出電壓示值誤差,V;U—平板電泳儀輸出電壓示值,V;Us—平板電泳儀輸出電壓實(shí)測(cè)值平均值,V。C.2不確定度來(lái)源及其標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定不確定度的來(lái)源包括測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度和電壓表本身引入的不確定度。C.2.1測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度在規(guī)定的電壓條件下,重復(fù)測(cè)定10次電壓數(shù)據(jù),如在示值100V的條件下,得到的測(cè)試數(shù)據(jù):100.2V,100.8V,101.4V,100.6V,101.6V,102.1V,101.8V,102.3V,101.6V,102.0V,則測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s為: uA=0.4V(C.3)C.2.2標(biāo)準(zhǔn)電壓表引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)電壓表的檢定證書(shū),查得該標(biāo)準(zhǔn)電壓表的最大允許誤差為±0.2%,服從均勻分布k=3。則標(biāo)準(zhǔn)電壓表引入的確定度分量為:uB=0.12VC.3合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度C.4擴(kuò)展不確定度uc=u+uC.4擴(kuò)展不確定度取k=2,則平板電泳儀100V校準(zhǔn)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為:注:電流和遷移距離的不確定度評(píng)定可以參考電壓的不確定度進(jìn)行評(píng)定注:電流和遷移距離的不確定度評(píng)定可以參考電壓的不確定度進(jìn)行評(píng)定。(C.4)(C.5)(C.6)JJF1654—20178附錄D校準(zhǔn)原始記錄推薦格式送檢單位:校準(zhǔn)日期:年月日儀器名稱:制造廠:型號(hào):出廠編號(hào):證書(shū)編號(hào):