通過擴增青霉素生物合成基因簇提高產黃青霉在固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵中的

通過擴增青霉素生物合成基因簇

提高產黃青霉在固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵中的

青霉素產量WorldJMicrobiol

Biotechnol(2008)第二組青霉素次級代謝殺菌影響青霉素產量高低隨機突變基因工程優(yōu)化基因過表達結構基因(pcbAB,pcbC和penDE)

構巢曲霉（Aspergillus

nidulans）產黃青霉（Penicillium

chrysogenum）

pcbC和penDE

pcbAB整個的基因簇pcbAB–pcbC–penDE

上述研究均是利用產黃青霉Wis54-1255完成的，Wis54-1255僅含有一個青霉素基因簇的拷貝并且只能產生少量的抗菌素，而且實驗結果只適用于液態(tài)發(fā)酵。本實驗中，研究者對比了在轉入整個青霉素基因簇后低產菌株（Wis54-1255）和高產菌株（P2-32）青霉素產量的差別，并且首次應用此法檢測轉化菌株在新興的固態(tài)發(fā)酵（SSF）技術（Suryanarayan2003;Barrios-Gonza′lezand

Mej?′a2007）中的反應。材料和方法產黃青霉Wis54-1255——青霉素低產菌株產黃青霉Wis54-1255npe10——其青霉素基因簇不完整產黃青霉P2-32——青霉素高產菌株可容納青霉素基因簇以串聯重復的方式擴增數倍產黃青霉NRRL1951（野生型）——用作基因文庫的DNA源枯草芽孢桿菌ATCC6633——用于在生物測定中評估青霉素G的產量大腸桿菌DH5a——用于粘性質?；蛭膸旌鸵话慊虿僮鞯氖荏w菌株材料和方法質粒載體cos區(qū)多克隆位點腐草霉素抗性基因位點（基因ble）——作為真菌選擇標記刪除PstI和XbaI的限制性酶切位點IztapaCos

基因組文庫的構建野生型NRRL1951IztapaCos載體全部DNA提取Sau3A1部分消化去磷酸化材料和方法BamHI-XbaI消化連接材料和方法基因組文庫的篩選pbcAB探針penDE探針【通過PCR方法獲得】以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG為引物，并包括基因pcbAB編碼區(qū)的3’末端序列和3’-UTR的起始序列【由HindIII酶切質粒pULJL33而獲得】大小為0.3kb，包含基因penDE的3’末端序列通過切口轉移標記上α-32P-dCTP于暗盒中在-70oC條件下用Hiperfilm-MP膠片曝光1小時30000cfu/dish副本材料和方法真菌的轉化E.coli30–80μg/ml的梯度培養(yǎng)基30–80μg/ml的梯度培養(yǎng)基轉化菌株轉化菌株30μg/ml腐草霉素30μg/ml腐草霉素30μg/ml腐草霉素Wis54-1255npe10Wis54-1255P2-32堿裂解40kbp粘性質?；D篩選對照材料和方法青霉素在瓊脂上的產量Somerson培養(yǎng)基制成的瓊脂塊（g/l,乳糖110，葡萄糖14，CaCO320，KH2PO46，MgSO4?7H2O6，谷物浸提液70，苯乙酸1.4）接種了枯草芽孢桿菌的胰蛋白胨（1%瓊脂）培養(yǎng)基中轉化菌株的菌絲體材料和方法液態(tài)發(fā)酵含有50ml復合生長培養(yǎng)基25oC,50rpm培養(yǎng)36小時取各菌株的孢子接種（1×106）每隔一定時間，取5毫升培養(yǎng)物含有45ml復合生產培養(yǎng)基25oC,250rpm培養(yǎng)144小時轉接作為副本材料和方法固態(tài)發(fā)酵經過0.3-0.6mm孔徑篩過的甘蔗渣改良的Somerson復合生產培養(yǎng)基接種（2×106孢子/ml）初始的水分含量設定為70%在每個Raimbault型圓柱發(fā)酵罐中加入12g固體培養(yǎng)基25oC條件下進行144小時，通氣量設定為2.4L/h取出并混勻圓形容器中的內容物取1克潮濕的培養(yǎng)基樣品測定其pH值和青霉素含量1700rpm離心20分鐘，青霉素被抽提到0.1M的磷酸緩沖液中從而使樣品的pH值為5.5（如果有必要可加入H3PO4調節(jié)pH值）。取60微升提取物或其稀釋物用于生物鑒定。材料和方法數據分析對于固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵實驗，實驗結果為兩個獨立實驗的平均值，樣品（整個培養(yǎng)瓶或圓柱發(fā)酵罐）為一式三份。對原始和轉化菌株的青霉素產量采用Student’sT-test方法進行分析。結果與討論在粘性質粒載體IztapaCos中構建了一個基因組文庫，該文庫攜帶有一個腐草霉素抗性基因，且可直接轉入真菌之中，不需進一步的亞克隆。首要目標——分離出一個含有整套青霉素基因簇的粘性質?？寺?。利用整套基因簇來增加青霉素基因的拷貝數而不是轉入單個的pcbAB和pcbC-penDE基因。為實現這一目標，用分別位于基因簇的兩個末端的探針pcbAB和penDE對基因組文庫進行了篩選。對E.coli進行的13次克隆證實這兩個探針都已分離出來并獲得了粘性質粒DNA。結果與討論以此方式形成的重組粘性質粒繼續(xù)呈遞進行Southern分析，分析中仍然使用相同的兩個探針以確定它們包含整套的青霉素基因簇。其中一個名為IztapaCos-pen5的粘性質粒（圖2第5列），被用于轉化產黃青霉。結果與討論轉化菌株Wis54-1255和P2-32被轉移至腐草霉素濃度不斷增高的瓊脂培養(yǎng)基上，以便選出含有高拷貝數的選擇標記基因ble的菌株，也就是含有高拷貝數青霉素基因簇的菌株。轉化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有60μg/ml腐草霉素添加劑的培養(yǎng)基上生長。同時利用在瓊脂鞘上的發(fā)酵來檢測所有轉化菌株的青霉素產量。檢測中青霉素產量最高的菌株是對60μg/ml腐草霉素有抗性的轉化菌株。我們將此兩種菌株中篩選出的青霉素產量最高的轉化菌株分別命名為TW和TP。對液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中TW和TP菌株的青霉素產量作了仔細檢測，并在同一實驗中與其親本菌株的發(fā)酵產量作了比較。在親本菌株內轉入IztapaCos（空載體）作為對照，該轉化菌株的青霉素產量略微低于原菌株的青霉素產量。結果與討論相對于親本菌株，轉化菌株TW和TP的青霉素產量在兩種培養(yǎng)體系中均有顯著提高。然而，來源于菌株P2-32的轉化菌株TP的青霉素產量則提高的更多。結果與討論關于產黃青霉(P.chrysogenum

)青霉素產量的早期研究表明微生物在固態(tài)發(fā)酵中的生理生化反應與在液態(tài)發(fā)酵中的大不相同，從而導致了它們在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中產量水平的差異。這一信息指出了設計能夠特別適合于固態(tài)發(fā)酵菌株的改進方法的必要性（Barrios-Gonza′lezetal.1993a;Barrios-Gonza′lezandMej?′a2007）。研究表明越接近于野生型的菌株在固態(tài)發(fā)酵能越高效地發(fā)揮其青霉素生產潛力，這說明在遺傳改良過程中，為適合液態(tài)發(fā)酵而開發(fā)的工業(yè)高產菌株，正在失去一些（未知）有助于其在固體培養(yǎng)基上很好地適應和生長的重要功能，（Barrios-Gonza′lezetal.1993a）。尋找這些引起所謂的固體培養(yǎng)生理性的“固體培養(yǎng)基因”已成為當前研究的主題（Barrios-Gonza′lezetal.2008;Ishidaetal.2000;TeBiesebekeetal.2005）。結果與討論這與實驗結果相符，菌株Wis54-1255比P2-32更接近于野生型，其由于額外拷貝的轉入而導致的在固態(tài)發(fā)酵中產量的增加比P2-32更高。相反地，對于菌株P2-32，額外拷貝的轉入則在液態(tài)發(fā)酵中起到更加顯著的作用。顯然，在Wis中更加保守的“固態(tài)培養(yǎng)基因”促進了其新的生物合成能力在固態(tài)發(fā)酵中的發(fā)揮，而這些基因在菌株P2中沒有很好地保留（或激活）。另一項試驗結果也可用相同的原理來解釋，那就是Wis在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵（培養(yǎng)系統(tǒng)）間產量水平的差別在TW轉化株上更加顯著，而這種差別在P2轉化株上則較小。結果與討論高青霉素滴度產黃青霉工程菌內含有高拷貝的青霉素基因簇，且此高拷貝以串聯重復方式排列（Fierroetal.1995;Newbert1997）。到目前為止，通過轉入額外青霉素基因拷貝的方式增加青霉素產量的研究均是在含有單拷貝青霉素基因簇的低產菌株上完成的（Veenstraetal.1991;Theilgaardetal.2001）。我們首次使用了P2-32菌株，據報道它含有多達14個拷貝的青霉素基因簇（Barredoetal.1989）。Thykaer和Nielsen（2003）提出存在于一株菌株內使產量增高的基因簇拷貝數有一個上限；他們指出超過5個拷貝之后，基因簇拷貝數與青霉素產量之間不再有線性關系。我們的實驗結果顯示即使是P2-32這種有著高拷貝青霉素基因簇的菌株，也是對提高青霉素基因數量的改進策略高度敏感的。結果與討論如前所述，P2-32轉化株在液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中均比Wis54-1255轉化株顯示出更高的青霉素產量的增加（相比于其親本菌株）。對這些結果有種與生物合成基因無關的解釋。P2是一個不斷經過突變和篩選而得的高青霉素產量菌株。這意味著它已經積累了很多突變，而很多這些突變在功能上與生物合成基因不同但可以互補（附屬基因），比如更高的輸出能力。很多這類基因已被描述（Kieletal.2005;Lamas-Maceirasetal.2006;Garc?′a-Ricoetal.2008）。這些突變使得更高的青霉素生物合成潛能得到更好地表達（由于生物合成基因的擴增）。因此，已存在于菌株P2中的互補突變必定使得菌株對通過增加青霉素基因簇拷貝數后獲得的更高的生物合成潛能進行更高效的利用。結果與討論另外，本實驗首次顯示基因劑量的增加對固態(tài)發(fā)酵中次級代謝物產量的提高也同樣適用。在這點上，可以預見本實驗中提出的策略在其最有效的形式下，也可用于其它更適用于固態(tài)發(fā)酵的實驗，如Ba