灌木辣椒種質(zhì)鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法

3DB36/XXXXX—XXXX灌木辣椒種質(zhì)鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子標(biāo)記法快速鑒定灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）種質(zhì)技術(shù)有關(guān)的術(shù)語和定義、儀器設(shè)備與主要試劑耗材、溶液配制、核心引物、參照種質(zhì)、操作步驟、指紋比對(duì)和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）種質(zhì)的SSR分子指紋比對(duì)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本規(guī)程，凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1待測(cè)種質(zhì)待鑒定的疑似灌木辣椒種質(zhì)，由送檢人提供。3.2參照種質(zhì)用于與待測(cè)種質(zhì)進(jìn)行指紋比對(duì)的若干標(biāo)準(zhǔn)灌木辣椒種質(zhì)和一年生辣椒種質(zhì)。3.3核心引物多態(tài)性好、PCR擴(kuò)增穩(wěn)定的一套SSR引物。3.4指紋圖譜采用SSR核心引物（或相當(dāng)于核心引物）擴(kuò)增出的待測(cè)種質(zhì)和參照種質(zhì)的DNA片段，通過變性聚丙烯酰胺電泳，得到不同大小的DNA片段圖譜。4DB36/XXXXX—XXXX3.5指紋比對(duì)將待測(cè)種質(zhì)與參照種質(zhì)的SSR指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，分析待測(cè)種質(zhì)與參照種質(zhì)的SSR指紋是否有差異，并確定其大小。4原理SSR分子標(biāo)記，廣泛分布于辣椒基因組中。不同種質(zhì)間每個(gè)SSR位點(diǎn)重復(fù)單位的數(shù)量可能不同，因而形成SSR標(biāo)記多態(tài)性。由于每個(gè)SSR位點(diǎn)兩側(cè)的序列一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，因此可根據(jù)其兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用PCR技術(shù)對(duì)兩條引物間的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。通過電泳分離得到大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，經(jīng)硝酸銀染色加以區(qū)分。因此，根據(jù)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，利用PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)可以鑒定灌木辣椒品種。5儀器設(shè)備與主要試劑耗材儀器設(shè)備及試劑、耗材參見附錄A。6溶液配制溶液配制方法參見附錄B。7核心引物核心引物相關(guān)信息見附錄C。8參照種質(zhì)參照種質(zhì)參見附錄D。在進(jìn)行等位變異檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同時(shí)包括相應(yīng)參照品種。9操作步驟9.1樣品準(zhǔn)備種子樣品的扦樣和保存，按照GB/T3543.2的規(guī)定執(zhí)行。取待測(cè)種質(zhì)和參照種質(zhì)的新鮮、幼嫩、健康葉片1片，每個(gè)種質(zhì)取10個(gè)個(gè)體，混合制樣并做好標(biāo)5DB36/XXXXX—XXXX記，用紗布包好并置于液氮罐中。9.2DNA提取9.2.1待測(cè)種質(zhì)和參照種質(zhì)采用改良CTAB法提取DNA，步驟如下：a）將混合樣品放入研缽中用液氮磨成粉末，然后迅速用2ml離心管將粉末勺進(jìn)管的2/5處，迅速加入預(yù)熱至65℃的CTAB提取液1ml（加入前先加入1%的β-巰基乙醇充分混勻后將2ml離心管放入65℃水浴鍋中，水浴60min，每隔5min搖蕩一次，使之充分反應(yīng)。b）取出離心管靜置至數(shù)分鐘后放入4℃高速低溫離心機(jī)中，13000rpm離心15min。取上清液至另一離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）后，充分混勻，靜置10min。13000rpm離心10min。c）取上清液800μl置于新的1.5ml離心管中。加入2/3體積冷的異丙醇，輕晃，置于-20℃冰箱30min或者過夜。d）取出步驟c的離心管在4℃下條件下，13000rpm離心10min，棄上清。用75%乙醇洗滌DNA兩次，放在桌面自然晾干。e）向1.5ml離心管中加入200μlddH2O將DNA溶解，再加5μl10mg/mlRNaseA37℃水浴60min。加入等體積200μl預(yù)冷的氯仿：異戊醇（24:1）混勻，靜置10min，12000rpm離心10min。f）取上清加入1/10(總)體積的NaAc（3mol/L2倍體積冷的無水乙醇。-20℃放置30min或更長(zhǎng)時(shí)間，在4℃下13000rpm，離心15min。用冷的75%乙醇洗滌沉淀兩次，放至桌面自然晾干。g）加200μl滅菌1×TE溶解DNA，并用核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度，將DNA稀釋到20ng/μl最后將離心管放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2若采用試劑盒法提取DNA，需按照試劑盒的說明進(jìn)行提取，并按照9.2.1步驟g）的方法存放。9.3PCR擴(kuò)增9.3.1PCR反應(yīng)體系0.4μl上游引物（10mM0.4μl下游引物（10mM0.1μlTaq酶（5U/μl2μlDNA模板（20ng/μl5.1μlddH2O。9.3.2PCR反應(yīng)程序所述PCR反應(yīng)程序：(1)94℃預(yù)變性4min；(2)94℃變性45s；(3)按附錄C推薦的引物退火溫度退6DB36/XXXXX—XXXX火45s；(3)72℃延伸45s；(5)重復(fù)步驟(2)-(4)，共35個(gè)循環(huán)；(6)72℃延伸10min；(7)4℃保存。9.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)9.4.1變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳9.4.1.1玻璃板處理用自來水分別清洗長(zhǎng)、短兩塊玻璃板洗凈，晾干后用95%的酒精淋洗玻璃板表面，晾干。用擦鏡紙（或質(zhì)量好的衛(wèi)生紙）將500μl親和硅烷工作液均勻涂在長(zhǎng)玻璃板上，將500μl剝離硅烷也均勻涂在帶有凹槽的短玻璃板上。等其完全反應(yīng)后（約4-5min后用無水乙醇反復(fù)擦拭玻璃板2-3次，除去玻璃板上多余的親和硅烷和剝離硅烷。操作過程中防治兩塊玻璃板互相污染。9.4.1.2組裝玻璃板將長(zhǎng)板平放，用厚度為0.4mm干凈的墊片放于玻璃板的左右兩側(cè)，將帶有凹槽的短板板壓于其上，并使兩塊玻璃底部和墊片對(duì)齊，然后用夾子夾緊兩側(cè)，用水平儀檢測(cè)玻璃膠室是否水平。用樣品梳反向插入，以梳子正好插入為適，不宜太緊也不宜太松，即可認(rèn)為組裝完好。9.4.1.3制膠取75ml6%工作膠溶液至燒杯中，加500μl10%過硫酸胺(APS)與50μlTEMED后，搖勻后迅速將膠液灌入玻璃膠室，注意防止灌入氣泡。待膠室灌滿后，在凹槽處鯊魚齒朝外輕輕插入樣品梳至適當(dāng)位置，在室溫下聚合1h以上。凝膠聚合后，輕輕拔出樣品梳，用水沖洗清洗掉凹槽處殘留的凝膠，清洗干凈備用。9.4.1.4預(yù)電泳將膠板垂直固定于電泳槽上，上槽加入約1200ml的1×TBE電泳緩沖液，約高出凹槽板2cm左右，下槽加入500ml的1×TBE電泳緩沖液。再次用膠頭滴管將凹槽處剩余凝膠碎片沖出。恒功率100W，設(shè)定電壓2000V條件下預(yù)電泳20min。9.4.1.5樣品制備在10μlPCR產(chǎn)物加入4μl上樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上94℃變性4min后，取出，立即放入碎冰中冷卻10min。9.4.1.6點(diǎn)樣及電泳在預(yù)電泳結(jié)束后，用膠頭滴管把加樣孔內(nèi)的氣泡沖出，把梳子正向插入凝膠，齒尖入膠深度以不超過lmm為宜，每個(gè)加樣孔加入5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，在膠板兩側(cè)點(diǎn)入DNAMarker。除待測(cè)樣品外，還應(yīng)同時(shí)加入?yún)⒄辗N質(zhì)的擴(kuò)增產(chǎn)物。設(shè)恒功率60W，電壓2000V條件下電泳，在溴酚藍(lán)指示劑接近膠板底部7DB36/XXXXX—XXXX時(shí)，結(jié)束電泳。在電泳過程中確保膠板溫度不高于55℃,以免玻璃板破裂。9.4.2銀染檢測(cè)采用簡(jiǎn)單快速的DNA銀染法：a)將長(zhǎng)、短玻璃板分開：電泳結(jié)束后，小心地將長(zhǎng)、短玻璃板分開，聚丙烯酰胺凝膠應(yīng)粘在長(zhǎng)玻璃板上。b)洗膠：在托盤A中用超純水漂洗凝膠2次，每次15s，在將玻璃板取出時(shí)，讓玻板豎直滴干10~20s，再進(jìn)行下一次洗滌。c)染色：在托盤B中加入1.2L染色液，將有膠的玻板放入托盤，在搖床輕搖10min。d)洗膠：將膠浸入裝有超純水中的托盤A清洗膠面約5s；取出瀝水后，立即放入盛有預(yù)冷顯影液e)顯色：把托盤C放在搖床輕搖5-7min至條帶清晰的呈現(xiàn)出來，不宜顯色太久，否走背景太深，影響讀帶。f)洗膠：用自來水沖洗玻璃板2min，將膠上多余的NaOH溶液沖去，避免其造成玻璃模糊而影響讀帶。g)干膠：通過熱對(duì)流或室溫放置，使膠變干。10指紋比對(duì)樣品每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異采用擴(kuò)增片段大小的形式表示。根據(jù)待測(cè)種質(zhì)與參照種質(zhì)的SSR條帶位置，確定是否有差異，并根據(jù)DNAMarker和待測(cè)樣品條帶的位置比較分析，確定待測(cè)種質(zhì)和參照種質(zhì)的片段大小。11結(jié)果判定用附錄C中引物進(jìn)行檢測(cè)，若待測(cè)種質(zhì)能擴(kuò)增出與參照種質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)灌木辣椒種質(zhì)相同條帶時(shí)，則判定待測(cè)種質(zhì)為灌木辣椒（C.frutescens）種質(zhì)；若待測(cè)種質(zhì)不能擴(kuò)增出與參照種質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)灌木辣椒種質(zhì)相同條帶時(shí)，則判定待測(cè)種質(zhì)不是灌木辣椒（C.frutescens）種質(zhì)”。8DB36/XXXXX—XXXX（資料性附錄）主要儀器設(shè)備與試劑、耗材A.1主要儀器設(shè)備A.1.1PCR擴(kuò)增儀器。A.1.2高壓電泳儀。A.1.3垂直電泳槽及配套的制膠附件。A.1.4高速冷凍離心機(jī)。A.1.5水平搖床。A.1.6制冰機(jī)。A.1.7電子天平。A.1.8微量移液器。A.1.9核酸測(cè)定儀。A.1.10高壓滅菌鍋。A.1.11純水儀。A.1.12恒溫水浴鍋。A.1.13磁力攪拌器。A.1.14PH計(jì)。A.1.15膠片觀察燈。A.1.16微波爐。A.1.17冰箱。A.2主要試劑在分析中均使用分析純?cè)噭?。A.2.1十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）。A.2.3乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）。A.2.4氯化鈉。A.2.5三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）。A.2.6濃HCL。9DB36/XXXXX—XXXXA.2.7Tris飽和酚。A.2.8RNaseA。A.2.9β-巰基乙醇。A.2.10氯仿。A.2.11異戊醇。A.2.12無水醋酸鈉。A.2.13無水乙醇。A.2.14丙烯酰胺。A.2.15甲叉雙丙烯酰胺。A.2.16硼酸。A.2.17尿素。A.2.18親和硅烷。A.2.19剝離硅烷。A.2.20過硫酸銨(APS)。A.2.21四甲基乙二胺（TEMED）。A.2.22甲醛。A.2.23硝酸銀。A.2.24氫氧化鈉。A.2.25無水碳酸鈉。A.2.2698%去離子甲酰胺。A.2.27溴酚藍(lán)。A.2.28二甲苯青FF。A.2.29DNAMarker（100bpladder）。A.2.30礦物油。A.2.31TaqDNA聚合酶。A.2.32SSR引物。A.2.33dNTPs。A.2.3410×Buffer緩沖液。DB36/XXXXX—XXXXA.2.35Mg2+。A.2.36液氮。A.2.37ddH2O，超純水。A.3主要耗材A.3.1離心管（1.5ml，2ml）。A.3.2移液器配套槍頭。A.3.3配套槍頭盒。A.3.496孔PCR板。A.3.5長(zhǎng)、短玻璃板。A.3.6燒杯。A.3.7研缽、研棒。A.3.8乳膠手套。A.3.9一次性手套離心管（1.5ml，2ml）。A.3.10量筒。A.3.11膠頭滴管。A.3.12玻璃棒。A.3.13濾紙。A.3.14漏斗。A.3.15托盤。DB36/XXXXX—XXXX（規(guī)范性附錄）溶液配制B.1DNA提取溶液的配制B.1.11mol/LTris-HCL溶液（PH=8.0）稱取24.22gTris堿置于250ml燒杯中，加入約160mlddH2O，充分?jǐn)嚢?，加入約8.4mlHCL調(diào)PH值至8.0，加ddH2O定容至200ml，121℃高溫高壓滅菌20min。B.1.20.5mol/LEDTA溶液（PH=8.0）稱取37.22gNa2EDTA·2H2O置于250ml燒杯中，加入約160mlddH2O，充分?jǐn)嚢?，用固體NaOH調(diào)PH值至8.0，加ddH2O定容至200ml，121℃高溫高壓滅菌20min。B.1.32%CTAB溶液稱取CTAB20g，NaCL81.9g，PVPP10g置于1000ml燒杯中，加入約500mlddH2O攪拌，再加入1mol/LTris-HCL（PH=8.0）溶液100ml，0.5mol/LEDTA（PH=8.0）溶液40ml，65℃水浴溶解，加ddH2O定容至1000ml，121℃高溫高壓滅菌20min。B.1.4酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）溶液量取100mlTris飽和酚的下層有機(jī)相，96ml氯仿，4ml異戊醇置于棕色瓶中，充分混勻。B.1.5氯仿/異戊醇（24:1）溶液量取240ml氯仿，10ml異戊醇置于玻璃瓶中，充分混勻。B.1.63mol/LNaAc溶液（PH=5.2）稱取12.34g無水NaAc置于100ml燒杯中，加入約20mlddH2O，攪拌溶解，用冰醋酸調(diào)PH值至5.2，加ddH2O定容至200ml，121℃高溫高壓滅菌20min。B.1.71×TEbuffer溶液用移液器吸取1mol/LTris-HCL（PH=8.0）溶液1ml，0.5mol/LEDTA（PH=8.0）溶液200μl，加ddH2O定容至100ml，121℃高溫高壓滅菌20min。B.1.875%酒精溶液量取150ml無水乙醇，50mlddH2O置于燒杯中，充分混勻。B.2PCR擴(kuò)增溶液的配制B.2.1SSR引物稀釋合成的引物（見附錄C）先在高速離心機(jī)中5000r/min離心30s，根據(jù)引物的說明書稀釋到工作液DB36/XXXXX—XXXX濃度10μmol/L。B.3變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)溶液的配制B.3.110×TBE緩沖液分別稱取Tris堿108g，硼酸55g置于1000ml燒杯中，量取加超純水定容至1000ml。B.3.240%丙烯酰胺凝膠溶液分別稱取丙烯酰胺380g和甲叉雙丙烯酰胺20g置于1000ml燒杯中，加入600mlddH2O慢慢攪拌，37℃水浴溶解，定容至1000ml，過濾，4℃保存。B.3.36%變性聚丙烯酰胺溶液稱取420g尿素置于1000ml燒杯中，再分別加入100ml10×TBE緩沖液和40%丙烯酰胺凝膠溶液150ml，加入600mlddH2O慢慢攪拌，37℃水浴溶解，加超純水定容至1000ml。B.3.410%APS溶液稱取5g過硫酸銨，加入50mlddH2O溶解，4℃保存一周即更換。B.3.51×TBE緩沖液量取10×TBE緩沖液100ml，用超純水定容至1000ml。B.3.6上樣緩沖液分別稱取溴酚藍(lán)25mg，二甲苯青25mg置于玻璃瓶中，加入98%去離子甲酰胺98ml和0.5mol/LEDTA（PH=8.0）溶液2ml，混勻。B.4銀染溶液的配制B.4.1染色液稱取硝酸銀1.2g，加超純水定容至1200ml。B.4.2顯色液稱取NaOH24g，無水碳酸鈉0.48g，加超純